七叶一枝花（Paris polyphylla）是百合科重楼属植物，为《中华人民共和国药典》收载的重楼药材基原植物，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效（国家药典委员会，2020），是云南白药、宫血宁胶囊、楼莲胶囊等80多种中成药产品的主要原料。当前，我国七叶一枝花每年的消耗量远远超出了其自然生长量，使其野生药用资源面临枯竭的威胁，而人工繁育七叶一枝花是缓解上述矛盾和促进其可持续发展的有效途径。因此，开展七叶一枝花人工繁育技术研究，指导高产优质人工栽培，对保护野生七叶一枝花资源、满足临床需求具有重要意义。

七叶一枝花的繁殖包括根茎切块繁殖、组织培养和种子繁殖3种方式，其中种子繁殖因其繁殖系数大、资源消耗少而更有利于规模化种植（马传江等，2016）。然而，目前七叶一枝花的种子繁殖研究仍处于低级阶段，种子萌发过程中生理生化指标方面的研究还较少报道。在种子萌发过程中，淀粉、蛋白质等物质通过相关酶的作用发生转化，进而为种子发芽提供营养和能量。淀粉酶主要由α-淀粉酶和β-淀粉酶组成，催化种子内淀粉降解。随着种子的萌发，抗氧化酶开始清除种子休眠期积累的有害物质活性氧（Bailly et al.，2008），抗氧化酶系统中主要以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）通过清除细胞内的活性氧，从而维持正常的细胞代谢功能。另外，种子萌发由遗传和环境因素共同决定，其萌发的激素调控可能是种子植物中一种高度保守的机制。有研究表明，吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellic acid，GA）等（宋松泉等，2020a，b，c）对种子萌发起着重要的生理作用。

七叶一枝花的种子萌发难，在自然条件下需要经过2年才能萌发成苗。本团队在前期研究发现，七叶一枝花种子在（20±1）℃下干燥保存4个月可促进七叶一枝花种子萌发，但其在萌发过程中所参与的多种酶、激素等因子的变化规律及其与种胚发育的相关性研究鲜有报道。因此，本研究以（20±1）℃下干燥保存4个月的七叶一枝花种子为材料，采用显微法观察不同萌发阶段七叶一枝花种子的显微结构，并采取生理生化法测定淀粉酶及抗氧化酶，同时采用质谱法测定8种植物内源激素的含量，分析萌发过程中胚率与酶活及内源激素之间的相关性，以期探索七叶一枝花种子萌发的生理机制，为七叶一枝花人工繁育栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用材料于2021年11月中旬采自广西壮族自治区百色市罗城县旦兴村上旦屯，经广西药用植物园余丽莹研究员鉴定为七叶一枝花（Paris polyphylla）的种子。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发处理

七叶一枝花种子采收后，立即洗去红色假种皮，阴干7 d，随后在（ 20±1）℃下干燥保存120 d。于2022年4月开始育苗，育苗采用蛭石+育苗盆法，育苗盆大小为22 cm × 15 cm × 8 cm，盆内有小格，育苗时每小格放置1粒种子，每盆40粒，育苗20盆。育苗时，先润洗蛭石，蛭石以手握不出水为宜，在育苗盆底部铺垫（2±0.5）cm厚蛭石，放置种子（种子先用自来水浸泡24 h，再用500 mg·L^-1 GA₃浸泡24 h），上面覆盖约0.3 cm厚的蛭石。育苗盆置于（20±1）℃的种子发芽箱中培养110 d，期间不定期补水，补水以保持蛭石表面湿润为宜。

根据七叶一枝花种子的种胚形态和不同发育阶段，将种子萌发过程划分为8个时期，即育苗1 d的种子标记为S1期，育苗15 d的种子标记为S2期，育苗29 d的种子标记为S3期，育苗44 d的种子标记为S4期，育苗58 d的种子标记为S5期，育苗72 d的种子标记为S6期，育苗96 d的种子标记为S7期，育苗110 d的种子标记为S8期。在58 d与72 d时，统计种子萌发率，以胚根突破种皮且发芽的种子为萌发种子，萌发率（%）=（每个取样时期的发芽种子粒数/取样的总种子粒数）×100。

1.2.2 种子显微结构观察及形态测定

于S1-S6期随机取10粒大小一致的种子，将种子从中间纵切，使用FAA固定液固定，随后采用番红固绿染色法制成永久玻片。将玻片放在OLYMPUS正置荧光显微镜BX53下观察、拍照，利用CellSens Dimension软件测量种子胚乳横径、胚乳纵茎及胚纵径，并计算胚率（普甜等，2023），胚率（%）=（胚纵径/胚乳纵径）×100。S7-S8期由于胚根过长，因此改在根系扫描仪EPSON 2000上进行图像采集，之后利用WinRHIZO软件分析胚乳横径、胚乳纵茎和胚纵径。

1.2.3 酶活测定

取1.0 g种子3份，先加入1 mL蒸馏水和少量石英砂，磨成匀浆后转入离心管中，再加入4 mL蒸馏水浸提15 min，期间摇动数次。于1 200×g下离心10 min，取上清液定容至10 mL，即为α-淀粉酶、β-淀粉酶待测酶液。另取0.5 g种子3份，分别加入5 mL的磷酸钠缓冲液（pH 7.8），研磨成匀浆后于8 000×g下离心20 min，取上清液用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和可溶性蛋白。α-淀粉酶和β-淀粉酶活性参考李小方和张志良（2016）的方法，SOD、POD、CAT、可溶性蛋白测定参考张志良等（2009）的方法。

1.2.4 内源激素的提取和测定

取大小一致的种子5粒，置于液氮研磨后称量100 mg，分别加入1 170 μL乙腈-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V），10 μL ISMix-A（混合内标A），20 μL ISMix-B（混合内标B），涡旋60 s，低温避光超声25 min，-20℃静置过夜，在4℃ 14 000×g下离心20 min，先取上清液900 μL至96孔去磷脂板中正压过滤，再加入200 μL乙腈-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V）洗脱1次，液氮吹干滤液，-80℃保存备用。测定时用200 μL甲醇∶水（1∶1，V/V）进行复溶。采用Waters I-Class LC超高效液相色谱系统进行分离。流动相：A液为0.05%甲酸-水溶液，B液为0.05%甲酸-乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为400 μL·min^-1；进样量为2 μL。洗脱梯度： 0~10.0 min，2%~98%B；10.0~10.1 min，98%~2%B；11.1~13.0 min，2%B。采用5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX）在正/负离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP ESI 源条件：离子源温度（Source Temperature）500℃，雾化气压（Ion Source Gas 1）45 psi，辅助气压（Ion Source Gas 2）45 psi，气帘气压（Curtain gas）30 psi，喷雾气压（IonSapary Voltage Floating）4 500 V；采用 MRM 模式检测待测离子对。

1.2.5 数据处理

利用IBM SPSS Statistics 22.0 和Excel 2019软件进行数据处理及制图，分析不同阶段的差异显著性；采用Duncan法进行多重比较，差异显著水平为0.05（P＜0.05）；采用Pearson法进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期七叶一枝花种子的形态解剖特征

由图1可知，S1期种子未萌发，视野处无种胚，为种胚未萌动时期（图1：B，C）；S2期可见幼胚心形，为心形胚时期（图1：D，E）；S3期幼胚进一步生长，幼胚细胞核清晰，细胞质浓，隐约可见子叶、胚根分化，为种胚膨大时期（图1：F，G）；S4期种胚可见子叶、胚芽、胚根的分化，种子珠孔处膨大，胚根未突破珠孔，为胚根未突破种皮时期（图1： H，I）；S5期子叶柄伸长，胚根突破珠孔，下胚轴进一步伸长，子叶呈卷曲状，为子叶柄伸长、胚根突破种皮时期（图1：J，K）；S6期种子胚轴突破珠孔，并加粗膨大呈柱形，子叶仍留在种皮内，呈圆柱形，胚根进一步伸长且在与胚轴连接处缩窄，为下胚轴突破种皮时期（图1： L，M）；S7期种子上胚轴伸长，胚根长为0.3~1 cm，为上胚轴伸长时期（图1： A）；S8期胚轴膨大呈纺锤形，胚根长大于1.0 cm，为胚根伸长时期（图1：A）。

根据种子的解剖特征，参考苏海兰等（2017a）的分类方法，将8个时期的种子归类为3个不同萌发阶段，分别为打破种胚休眠即将萌动阶段，含S1期；种胚生长发育至上胚轴休眠阶段，含S2期至S6期；上胚轴休眠结束至即将破土出苗阶段，含S7期、S8期。

不同时期七叶一枝花种子胚乳横径、胚乳纵径及胚纵径测量结果（表1）表明，在S1期至S4期胚乳纵径持续增长，43 d内增长率为48.67%，而胚乳横径则表现为缩窄，缩窄率为9.75%；在S5期至S7期胚乳横径、胚乳纵径无明显差异，但胚纵径均显著增长；S8期种子胚根进一步伸长，胚纵径、胚乳纵径显著高于其他时期。由七叶一枝花萌发过程可知，S1期未观察到种胚；S2期种胚初分化，胚率为1.78%；S3期、S4期种胚持续增长、胚率持续增长；S5期、S6期下胚轴突破珠孔且持续增长膨大，胚率分别为71.57%、87.09%；S7期、S8期，下胚轴增长减缓，而胚根则迅速增长，胚率分别为139.43%、318.53%。七叶一枝花种子在育苗58 d和72 d的萌发率分别为61.20%、80.40%。

2.2 不同时期七叶一枝花种子淀粉酶和抗氧化酶活性的变化

2.2.1 淀粉酶活性变化

由图2： A可知，七叶一枝花种子的α-淀粉酶活性随萌发进程在S4期出现小高峰，达440.7 μg·g^-1FW·min^-1，较S1期升高2.67倍，并在S6期下降至最小值，之后于S8期达到最大值502.83 μg·g^-1FW·min^-1，表明α-淀粉酶可诱导子叶和胚芽的发育以及胚根细胞的分化。由图2： B可知，七叶一枝花种子β-淀粉酶活性随萌发进程先下降后上升。S1期时β-淀粉酶活性较高，在S2期时该酶活性快速下降至10.11 μg·g^-1FW·min^-1，在S3-S7期呈现出波动性上升的趋势，并在S8期时其活性显著增加。七叶一枝花种子在不同萌发时期α-淀粉酶活性均明显高于β-淀粉酶，说明七叶一枝花的种子主要以α-淀粉酶水解淀粉和糖原，并提供碳水化合物和能量，从而促进种子的萌发。

2.2.2 抗氧化酶活性变化

在七叶一枝花种子萌发的不同时期SOD活性总体趋势变化不大，其中S1期和S6期显著低于其他时期 （图3： A）。POD活性在S1期至S7期的变化波动较大，但在S8期时活性显著增强，达11 388.23 U·g^-1 FW·min^-1（图3： B），表明POD可能参与调控七叶一枝花的种胚细胞生长，并促进种子萌发胚根伸长。CAT活性随萌发进程总体呈上升趋势，并且其活性在S7期、S8期时显著高于其他时期（图3：C），表明CAT可能参与调控胚乳分解且促进了下胚轴膨大和胚根伸长。可溶性蛋白含量随萌发进程先下降后升高，S1期至S5期的结果表明七叶一枝花种子内部的代谢活动增强，为种子的休眠解除提供物质和能量（图3：D）。

2.3 七叶一枝花种子内源激素含量和比例的变化

2.3.1 种子内源激素含量变化

不同萌发时期七叶一枝花种子各激素含量的变化较大。IAA、GA₃、ABA和SA含量呈逐渐下降趋势，并在S2期时含量最高，在S4期至S8期时含量显著下降（图4：A-C，G）。IAA含量在S6期时下降至5.5 ng·g^-1FW（图4：A）；GA₃含量在S4期时下降至11.06 ng·g^-1FW（图4：B）；ABA含量在S8期时最低，仅为S2期的15.32%（图4：C）。水杨酸（salicylic acid，SA）含量在S4期至S8期时显著下降（图4：G）。细胞分裂素类（cytokinins，CTKs）含量在不同时期无显著性差异（图4：D）。1-氨基环丙烷羧酸（l-aminocyclo-propane-l-carboxylic acid，ACC）是乙烯的合成前体，而乙烯可促进种子休眠解除。ACC含量随七叶一枝花种子萌发进程呈现出先下降后上升的趋势，并在S4期时最低（60.59 ng·g^-1FW），在S8期时最高，达162.51 ng·g^-1FW（图4：E）。茉莉酸（jasmonic acid，JA）含量在S2期、S4期、S6期时无显著性差异，而在S8期则显著上升，为S4期的10.01倍（图4： F）。油菜素内酯（brassinolides，BRs）含量随种子萌发进程呈现出逐渐上升的趋势，在S8期高达6 572.19 ng·g^-1FW（图4：H）。

2.3.2 种子内源激素比例变化

由图5可知，IAA/ABA、GA₃/ABA变化趋势基本相似，即先降后升，但IAA/ABA在S6期降至最低，而GA₃/ABA在S4期时降至最低，表明IAA、GA₃在种子萌发作用上具有协同效应。CTKs/ABA随种子萌发进程不断升高。

2.4 七叶一枝花的种子酶活性、内源激素含量与种子胚率的相关性

由表2可知，在七叶一枝花种子萌发过程中，ABA、IAA、GA₃含量与胚率呈显著负相关，而ACC、JA、BRs含量与胚率则呈显著正相关，并且POD、CAT、β-淀粉酶与胚率呈极显著正相关。通过比较激素含量之间的相关系数，结果为RABA＞RBRs＞RACC＞RJA＞RIAA＞${\mathrm{R}}_{{\mathrm{G}\mathrm{A}}_3}$＞RSA＞RCTKs。

3 讨论与结论

3.1 七叶一枝花的种胚生长阶段划分和种子育苗管理

苏海兰等（2017a）将七叶一枝花种子萌发分为3个阶段，即未萌发、未解除休眠阶段（第一阶段）；萌发后上胚轴并不伸长，当年不出苗，处于上胚轴休眠阶段（第二阶段）；上胚轴伸长，子叶发育完全，即将破土出苗阶段（第三阶段）。本研究与苏海兰等（2017a）的划分方法略有不同，在第二阶段的上胚轴休眠阶段中，可细分为5个时期，即心形胚时期（S2期）、种胚膨大时期（S3期）、胚根未突破种皮时期（S4期）、子叶柄伸长和胚根突破种皮时期（S5期）、下胚轴突破种皮时期（S6期）。本研究在七叶一枝花种子萌发进程中，露白、胚根伸长和上胚轴萌发是种子萌发进程的重要标志：种子在进入S5期时，种子开始露白，此时取出种子播种，可提高种子田间存活率；而在种子进入S6期后，种子的胚轴突破种皮，种胚仅靠子叶柄与种壳相连，若此时取出种子播种，就容易造成子叶柄断裂，从而导致种胚死亡。

注：数值为平均值±标准差； 同列不同小写字母表示差异显著 （P＜0.05）; 同列相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05）。

Note: Values are $\stackrel{-}{x}\pm s$ deviation; different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P＜0.05) ; the same lowercase letter in the same column indicates no significant differences (P＞0.05) .

3.2 种子酶活性变化对七叶一枝花种子萌发的影响

种子通过各种酶的作用，促进蛋白质、淀粉、脂质等物质转化，进而促进种胚发育、胚根分化和出苗等活动。本研究结果表明，七叶一枝花种子的α-淀粉酶活性在种子休眠未解除时较低，珠孔膨大时上升，与苏海兰等（2017b）的研究结果一致，但随后酶活性下降，至S8期时再度上升，与苏海兰等（2017b）的研究结果不同，这可能与本研究中七叶一枝花种子的胚根伸长发生时期较后有关，α-淀粉酶分解淀粉所释放的能量作用于胚根的伸长，从而导致α-淀粉酶活性升高（王凤凤等，2017）。

本研究中，七叶一枝花从种子休眠期向萌动期过渡，并伴随着体内抗氧化酶活性的变化，SOD活性在S2-S5、S7-S8期均呈高值，此类时期均伴有种胚细胞增多的特征，而在S1、S6期SOD活性较低。这与浙贝母（许美玲，2019）、滇重楼（李戈等，2015; 苏海兰等，2018）、华重楼（李昭玲等，2015）萌发时SOD的变化无规律略有不同。但一般认为，种子维持较高的SOD活性则有利于对活性氧以及过氧化氢的清除，为种子萌发创造了良好条件（Buetler，et al.，2004; Liszkay et al.，2004）。本研究中，POD活性在胚根伸长时期较其他时期显著提高，这与七叶一枝花（苏海兰等，2017a）、天山郁金香（张伟，2020）的研究结果一致，POD活性参与植物细胞壁的形成和脂肪酸的氧化，在S8期时该酶活性增加可为胚根伸长提供能量。

3.3 IAA、GA及ABA与七叶一枝花种子萌发的关系

植物激素对种子萌发有至关重要的调控作用，七叶一枝花随着种子的萌发进程，种子内源激素含量呈现出不同的变化趋势，从而参与调控种子。本研究中，七叶一枝花种子IAA含量高峰出现在S2期，该高峰的出现可能与种子的种胚形成有关，本研究结果与多花黄精（张武君等，2022）、紫花苜蓿（李浩天等，2023）的研究结果相似，但与苏海兰等（2017a）与李晓冬（2018）的研究结果却不同。Liu等（2013）的研究发现，IAA在拟南芥种子的休眠过程中起正向调控作用，是第二类促进种子休眠的激素；而本研究发现，IAA含量在心形胚时期最高，可能与种子刚结束休眠有关。本研究结果显示，IAA含量与胚纵茎、胚率呈显著负相关，与七叶一枝花（苏海兰等，2017a）、滇重楼（浦梅等，2016）的研究结果不同，这可能与不同的萌发阶段需要不同浓度的IAA刺激有关。成京晋等（2018）的研究发现，多花黄精种子在层积过程中IAA含量无明显变化规律；李浩天等（2023）的研究发现，紫花苜蓿种子IAA含量随萌发进程递减，这与本研究的结果相似。

本研究中，七叶一枝花的种子ABA含量随萌发进程降低，这与滇重楼（浦梅等，2016）、棉花（夏军等，2019）的种子萌发现象相似，而与苏海兰等（2017a）对七叶一枝花的种子萌发现象不同。ABA正向调控种子的休眠诱导和维持（宋松泉等，2020b），并且在吸胀的休眠种子中其萌发的抑制是在吸胀过程中维持较高水平的ABA积累（Iwasakiet al.，2022）。但是，Schmitz等（2002）的研究认为，种子之所以萌发是因为胚对ABA敏感性下降，与ABA含量降低关系不大。

注：* 表示显著相关 （P＜0.05）；** 表示极显著相关 （P＜0.01）。

Note: * indicates significant correlation (P＜0.05) ; ** indicates extremely significant correlation (P＜0.01) .

GA₃含量在S2期大量积累，此时形成心形胚，表明GA₃参与调控七叶一枝花种子的种胚形成和发育，可能作为上游信号调控七叶一枝花种子整个萌发进程的开始，这与苏海兰等（2017a）的研究结果不同。种子萌发与否取决于胚生长的机械力和胚乳的限制力，前期较高的GA₃含量既可以弱化种胚覆盖层的机械阻力（宋松泉等，2020c），也可以诱导α-淀粉酶进而动员贮藏物的降解（Hauvermale，et al.，2012）。本研究发现GA₃对七叶一枝花种子的萌发有显著促进作用，而GA₃含量在S4期和S8期较低，推测GA₃可能与胚根伸长关系不大。在拟南芥种子萌发过程中，GA生物合成的时空表达模式显示，GA₄仅在胚根伸出前积累（Urbanova &Leubner-Metzger，2016），随后含量下降，本研究结果与之相似。

种子萌发不仅受内源激素各自含量的影响，还与各类激素之间的平衡有关，特别是促进生长激素与抑制生长激素之间的比例和平衡，而ABA与GA之间的动态平衡是种子打破休眠与萌发的关键（佐月和许永华，2021）。本研究结果显示，七叶一枝花种子在S2期GA₃/ABA比值较高，可能与该时期接近S1期有关，ABA和GA的比值是植物种子休眠状态的主要调节器（佐月和许永华，2021），S1期是七叶一枝花种子打破休眠开始萌发的始点，往往含有较高GA₃/ABA比值，而往后GA₃/ABA比值降低。IAA与ABA对种子萌发具有协同作用， Shuai等（2017）研究表明IAA可促进ABA的生物合成且降低ABA分解，并可增强ABA信号转导（Shu et al.，2016）。本研究中，七叶一枝花的IAA/ABA值从S2-S6期逐渐降低，而在S8期因IAA促进胚根生长（Casanova-Sáez &Voβ，2019）而进一步升高。

综上所述，根据种胚形态可将七叶一枝花种子萌发过程细分为8个时期，在不同时期种子内源激素含量及相关酶活性各不相同，其中α-淀粉酶活性、POD活性可能与种胚胚根伸长有关，GA₃可能影响七叶一枝花种胚形成，而ABA则可能抑制种胚的生长发育。

参考文献