珠子参叶是五加科（Araliaceae）植物珠子参（Panax japonicus var. major）的干燥带梗叶，性微寒，苦，甘；归肝、肺、胃经，具有清肺止咳、生津、润喉、防暑、滋补强壮的功效，在民间多泡茶饮用（宋小妹，2011; 国家药典委员会，2020）。珠子参叶的应用历史可追溯到清朝，由于当时人参和人参叶价格日渐昂贵，珠子参叶作为人参和人参叶的替代品开始使用（赵学敏，1963; 陆维承，2016）。

脂肪酶是水解膳食中脂质的关键酶（Jaeger &Reetz，1998; 廖家乐，2022），参与脂肪消化、吸收、利用的全过程（王哲等，2013）；抑制其活性能有效减少脂质的消化吸收，从而降低血脂水平，抑制脂肪酶的活性是治疗高脂血症、肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病的有效策略（Yun，2007; de la Garza et al.，2011）。三萜皂苷类化合物具有脂肪酶抑制作用，是潜在的有效治疗肥胖及其相关疾病的化合物（Han et al .，2005; Yoshizumi et al.，2006; Ercan &El，2016; Liu et al.，2017; 冯海燕，2019；邱悦，2020; Navarro Del Hierro et al.，2020）。

珠子参作为常用中药材，生长缓慢成药周期长，目前野生珠子参已处于濒危状态，而珠子参叶作为非药用部位被遗弃，造成资源浪费。前期课题组研究发现，珠子参叶的主要化学成分是三萜类化合物，包括20（22）E，24-达玛二烯-3β，6α，12β-三醇、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃和人参皂苷Rc、人参皂苷Rs₂、西洋参皂苷R_l、人参皂苷Rs₁、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd₂、Gypenoside IX、20（21），24-达玛二烯-3β，6α，12β-三醇、 20（22）Z，24-达玛二烯-3β，6α，12β-三醇、珠子参苷Z等，还有5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮（赵东东等，2013；何瑞等，2014；杨延等，2019；张化为等，2020）。因此，探究珠子参叶的化学物质基础和生物活性，对提高珠子参全植株的利用率具有重要意义。目前，珠子参叶皂苷的脂肪酶抑制机制及降血脂作用尚未见报道。本研究以珠子参叶为研究对象，依托完善的天然产物开发研究平台，综合利用现代色谱分离手段和现代药理学方法，拟探讨以下问题：（1）珠子参叶皂苷部位主要成分为哪些； （2）珠子参叶皂苷部位对脂肪酶是否具有抑制作用；（3）珠子参叶皂苷部位对脂肪酶抑制类型为哪种；（4）珠子参叶皂苷部位成分与哪种残基结合可提高脂肪酶抑制活性；（5）珠子参叶皂苷部位是否可以降脂。

1 仪器与材料

1.1 主要实验仪器和药品

分析电子天平[EX125ZH型，奥豪斯仪器（常州）有限公司]；多功能酶标仪（Synergy TM H1型，美国宝特Bio-Tek）；高效液相色谱仪（Waters e2695 型，美国Waters公司）；奥利司他胶囊（批号：190204，重庆华森制药有限公司）；移液器（Research Plus系列，德国艾本德股份公司Eppendorf AG）；低速台式离心机（TDL-50B型，上海安亭科学仪器厂）；高速台式离心机（TG16-WS型，湘仪离心机仪器有限公司）；皱褶假丝酵母脂肪酶（批号：S25740）、4-硝基苯基棕榈酸酯（4-nitrophenyl palmitate，4-NPP，批号：EC250112）、柠檬酸钠（批号：75164），以上试剂均购自美国Sigma公司；色谱乙腈（AH015型，Honeywell）；DMSO（批号：D6370）购自北京博奥拓达科技有限公司； D101型大孔树脂购自天津南开大学化工厂；20（S）-人参皂苷Rg₂（货号：B21058）、20（R）-人参皂苷Rg₂（货号：B21727）、人参皂苷Rb₂（货号：B21051）、人参皂苷Rb₃（货号：B21052）、人参皂苷Rd（货号：B21054）均购自上海源叶生物科技有限公司；人参皂苷Rh₂（货号：111748）购自中国药品生物制品鉴定所；50 mmol·L^-1 Tris-HCl（pH:7.8）（批号：BB0512）购自陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司。

1.2 实验动物

SPF级SD小鼠，共60只，体重为18~22 g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（川）2020-030，适应性饲养5 d。

2 实验方法

2.1 HPLC法分析化学成分

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agela Technologies lnnoval ODS-2（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脱：0~10 min，10%→28%B; 10~27 min，28%→28%B; 27~33 min，28%→31%B；33~46 min，31%→31%B；46~50 min，31%→36%B；50~55 min，36%→39%B；55~70 min，39%→60%B；柱温30℃；进样量10 μL，检测波长203 nm；流速1.0 mL·min^-1。

2.1.2 供试品溶液的制备

本实验所用药材由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科人参属珠子参（Panax japonicus var. major）的干燥叶。参照赵东东等（2013）的方法提取珠子参干燥叶。取干燥的70%乙醇洗脱部位粉末约 0.05 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声提取10 min，放冷，称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，得到所需浓度的溶液。

2.1.3 对照品溶液的配制

精密称取对照品20（S）-人参皂苷Rg₂、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh₂，用甲醇分别制成浓度为0.10、0.25、0.10、0.25、0.11、0.50 mg·mL^-1的溶液。

2.2 脂肪酶抑制实验及动力学机制研究

2.2.1 不同皂苷对脂肪酶活性的影响

脂肪酶抑制活性测定参考（Liu et al.，2018；王亚凤等，2020；黄桂等，2021）报道的方法稍加修改，脂肪酶Tris-HCl溶液浓度为280 U·mL^-1。4-NPP 的DMSO溶液浓度750 μmol·mL^-1，奥利司他的浓度为250 μmol·mL^-1，珠子参叶皂苷部位以DMSO为溶剂配制成浓度为2.52 mg·mL^-1的溶液，20（S）-人参皂苷Rg₂、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh₂以DMSO为溶剂配制成500 μmol·mL^-1的溶液，使用时稀释成不同浓度，用于后续实验。

将25 μL珠子参叶皂苷部位（珠子参叶皂苷部位摩尔质量按奥利司他摩尔质量算，终浓度为0、0.625、6.25、62.5、125 μmol·mL^-1）、人参皂苷Rb₃（终浓度为0、5、12.5、125、250 μmol·mL^-1）、20（S）-人参皂苷Rg₂（终浓度为0、1、2.5、5、12.5 μmol·mL^-1）、20（R）-人参皂苷Rg₂（终浓度为0、25、50、125、250 μmol·mL^-1）、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh₂（终浓度为0、12.5、25、125、250 μmol·mL^-1）和45 μL胰脂肪酶于96孔板中37℃孵育30 min，再加入90 μL 的4-NPP （终浓度为750 μmol·mL^-1）37℃恒温反应20 min，加入柠檬酸钠终止反应，405 nm下测定吸光度。

按照如下公式计算胰脂肪酶活性：

胰脂肪酶活力=（A_样品-A_样品对照）/（A_空白-A_空白对照）×100%。

式中： A_样品为加入样品和活性酶反应后的吸光度；A_样品对照为加入样品和失活酶反应后的吸光度；A_空白为加入活性酶和DMSO反应后的吸光度；A_空白对照为加入失活酶和DMSO反应后的吸光度。所有反应中均有4-NPP。

2.2.2 不同皂苷对脂肪酶活性的抑制机理

按照“2.2.1”项下的珠子参叶皂苷部位、人参皂苷Rb₃、20（S）-人参皂苷Rg₂样品浓度和4-NPP底物浓度，参照陈静等（2021）的方法稍加修改，通过改变脂肪酶浓度（终浓度为0、70、140、280、560 U·mL^-1）测定不同浓度样品在不同浓度脂肪酶催化下水解4-NPP底物产生的吸光度。将25 μL不同样品及浓度的皂苷和45 μL胰脂肪酶于96孔板中37℃孵育30 min，加入90 μL 4-NPP（终浓度为750 μmol·mL^-1），405 nm下测定吸光度。按下式计算相对酶活力：

相对酶活力=（A₂-A₁）/（A₄-A₃）×100%。

式中： A₁和A₂是不同皂苷、脂肪酶与4-NPP反应初末的吸光度；A₃和A₄是脂肪酶与4-NPP反应初末的吸光度。

2.2.3 不同皂苷对脂肪酶活性的抑制类型和抑制常数

按照“2.2.2”项下的测定方法，固定脂肪酶的浓度，改变4-NPP（终浓度为0.375、0.75、1.5、3 mmol·mL^-1），测定不同浓度皂苷对脂肪酶催化水解4-NPP后产生的吸光度。

2.3 分子对接数据库及软件

所用软件包括 ChemBioDraw3D、AutoDockTools1.5.6、PyMOL、CADD1.5.6、Vision1.5.6。从PubChem数据库中下载相关化合物的2D结构文件，靶蛋白的晶体结构从PDB数据库中获取，利用PyMOL软件对靶蛋白进行去除水分子、加氢等前处理，使用软件AutoDock Tools1.5.6对化合物和靶蛋白进行分子对接。靶蛋白及其结合位点为ILPB蛋白的A-BOG位点。

2.4 动物实验

2.4.1 药物的制备及给药

实验前将小鼠随机分为6组：空白组（10只）、高脂血模型组（10只）、奥利司他组（10 只）、皂苷部位高中低剂量组（各10只）。其中，空白组饲喂基础饲料，其他组饲喂高脂饲料，建立高脂血症模型。

高脂饲料配方如下：15%猪油、5%蛋黄、20%糖、0.5%盐、0.5%香油。

给予小鼠高脂饲料35 d后开始给药，空白组及高脂血模型组给予一定剂量的生理盐水，奥利司他组按照 46.8 mg·kg^-1 灌胃给药，各给药组剂量按人每日服用量和提取物收率计算，高剂量组按照 117.0 mg·kg^-1 给予小鼠珠子参叶皂苷部位提取物（相当于70 kg 的成人每日服用 20 g 提取物），中剂量组按照 58.5 mg·kg^-1 给予小鼠珠子参叶皂苷部位提取物，低剂量组按照 29.3 mg·kg^-1 给予小鼠珠子参叶皂苷部位提取物，每日给药一次，连续灌胃3周，于末次给药后称量体重。空白组、高脂血模型组小鼠给药期间分别继续饲喂基础饲料及高脂饲料，期间受试小鼠均正常摄食摄水。

2.4.2 样本采集及处理

末次给药后，所有小鼠禁食不禁水，16 h 后眼球取血，全血静置，于 4℃下保存，再以 3 000 r·min^-1的转速离心 15 min，分离血清，按组依次分装，于-80℃冰箱中保存，备用。

2.4.3 生化指标的测定

血清总胆固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的含量分别按照试剂盒的说明书进行测定。

2.5 统计学处理

所有的统计分析均使用 Graphpad Prism 8.0.1 软件，计量数据以“均数±标准差”（ $\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组比较用t检验，多组之间两两比较采用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 色谱数据采集

由图1可知，珠子参叶皂苷部位的主要成分为20（S）-人参皂苷Rg₂、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh₂。

3.2 脂肪酶活性测定结果

以“2.2.1”所述方法测定各皂苷的脂肪酶抑制活性，测试结果见表1。由图2可知，珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷 Rg₂、人参皂苷Rb₃反应体系吸光度随时间的延长而逐渐增大，吸光度随时间变化的曲线通过原点，不存在迟滞效应。在相同反应时间下，随着珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷 Rg₂、人参皂苷Rb₃样品浓度的增大，曲线的斜率不断减小，即脂肪酶催化水解4-NPP的速度不断降低，说明其具有抑制脂肪酶活性的作用。在反应0~7.5 min时A_{405 nm}-Time曲线近似呈线性关系，随着时间的延长，曲线逐渐平坦，斜率降低，反应的速度也随之降低，此时测得的酶活力不能代表真实的酶活力，故取反应7.5 min时的反应速度为初速度。由表1和图3可知，珠子参叶皂苷部位、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rd、人参皂苷Rh₂、20（S）-人参皂苷Rg₂、20（R）-人参皂苷 Rg₂、人参皂苷Rb₃的IC₅₀分别为0.14、28.00、31.00、18.00、8.73、2.30、60.76 μmol·L^-1。

3.3 不同皂苷对脂肪酶的抑制作用机理

按照“2.2.2”项下的测定方法，将反应液置于酶标仪中37℃恒温，间隔20 s测定1次共7.5 min，选取（0~7.5 min吸光度随时间的改变拟合方程，其斜率）即为酶活力值。以相对酶活力对酶浓度作图，根据图像判断不同皂苷对脂肪酶活性的抑制作用是否可逆。如果作图结果为一组直线且通过原点，则为可逆抑制；如果只得到一组平行直线，则为不可逆抑制。

由图4可知，以酶活力对酶浓度作图时，得到一组通过原点的直线，该直线的斜率随着珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₃浓度的增大而逐渐降低，表明珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₃是通过抑制脂肪酶活力导致脂肪酶催化水解4-NPP的速度减慢，而不是通过降低有效酶量所导致的，说明珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rb₃对脂肪酶活性的抑制属于可逆型抑制。

3.4 不同皂苷对脂肪酶活性的抑制类型和抑制常数

利用“2.2.3”项下的测定结果按照V=ΔA₄₀₅/t计算催化反应速度，以反应速度的倒数（1/V）对底物浓度的倒数（1/S）作图，判断珠子参叶皂苷部位、人参皂苷Rb₃、20（S）-人参皂苷Rg₂对脂肪酶活性的抑制类型和抑制常数。

由Lineweaver-Burk双倒数图（图5）可知，3个样品图均为相交于横轴一点的线，随着样品浓度的增大，K_m值不变，V_m值逐渐减小，符合非竞争型抑制类型的特征。以Lineweaver-Burk曲线中的斜率对3个样品浓度作图，得到3个样品的K_m值分别为1.07，0.83，8.64（图5），抑制剂的结合常数K_I分别为0.27、2.53、0.17（图6），以截距对浓度得到抑制常数K_IS分别为21.46、28.00、3.80（图7）。

3.5 分子对接结果

采用分子对接技术探讨配体与蛋白ILPB的相互作用。20（R）-人参皂苷Rg₂与ILPB的ARG38A、LEU41A、ASP331B、SER333B、ARG337B、LYS367B形成氢键结合，与HIS30A、ALA40A、 ILE248B等氨基酸残基形成疏水互作，见图8：A；20（S）-人参皂苷Rg₂与ILPB的结合方式与20（R）-人参皂苷Rg₂相似见图8：B，其不同之处在于20（S）-人参皂苷Rg₂糖苷基4位和5位氢键同时与SER333B氨基酸残基连接；人参皂苷Rb₂与ILPB的结合方式见图8：C，人参皂苷Rb₂与GLU13A、GLN29A、ASP31A、LEU36A、SER35A、ARG13A、CYS39A、ASP331B、ARG337B、LYS367B形成氢键结合，与GLU13A残基形成疏水互作，人参皂苷Rb₂与LYS367B之间形成π-阳离子相互作用力，嵌入ILPB蛋白活性口袋中实现与ILPB的结合；人参皂苷Rb₃与ILPB的结合方式见图8：D，人参皂苷Rb₃与ASP31A、LEU36A、LEU41A、LYS42A、CYS61A形成氢键结合，GLU13A、ARG38A、ALA40A等氨基酸残基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中实现与ILPB的结合；人参皂苷Rd与ILPB的结合方式见图8：E，人参皂苷Rd与ASP31A、ARG38A、ALA40A、ALA43A、ARG44A形成氢键结合，与GLU13A、ALA40A、LEU41A、ALA43A等氨基酸残基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中实现与ILPB的结合；人参皂苷Rh₂与ILPB的结合方式见图8：F，人参皂苷Rh₂与GLN29A、LYS42A、GLU48A、CYS61A形成氢键结合，与GLU13A、ALA40A、LEU41A、ILE248B、ALA332B氨基酸残基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中实现与ILPB的结合；奥利司他与ILPB的结合方式见图8：G，奥利司他与ARG337B、ALA332B、ASP331B 形成氢键结合，ILE248B和LEU41A 氨基酸残基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中实现与ILPB的结合。

3.6 胆固醇和甘油三酯测定结果

由图9可知，高脂血模型组小鼠血清中TG、TC含量均明显高于空白组（P＜0.01），说明高血脂模型造模成功；皂苷部位的低、中、高剂量组小鼠血清中的TG、TC含量均明显低于高脂血模型组（P＜0.01），其中高剂量组降低TG作用与奥利司他组相当，降低TC作用优于奥利司他组。

4 讨论与结论

长期以来，由于对合理开发利用中药植物资源认识不足，导致对中药植物资源进行掠夺式过度采收，使得一些中药资源处于濒危状态。为了保护和合理开发珠子参资源，对珠子参整株植物进行系统化学研究和药用价值探索，以提高珠子参资源的利用率。珠子参地下部分为传统药用部位，其地上部分的药用价值有待开发，而在地下部分采收过程中地上部分大多被遗弃，药农仅保留少量在民间泡茶饮用，造成一定的资源浪费。另外，珠子参为多年生草本植物，每年秋季种植基地和野生资源的珠子参地上部分自然枯萎腐烂，未被合理采收使用。前期研究发现，珠子参叶主要成分为三萜皂苷类化合物且具有脂肪酶抑制作用，本研究采用HPLC确定珠子参叶皂苷部位的主要单体成分，测定其体内外脂肪酶抑制作用，为珠子参资源合理开发利用提供了依据。

脂肪进入小肠后被胰脂肪酶水解，中链甘油三酯被水解为游离脂肪酸和甘油，中链脂肪酸与白蛋白结合，通过门静脉转移到肝脏；长链甘油三酯被水解为游离脂肪酸、单酰基甘油酯和甘油，长链脂肪酸在小肠中形成乳糜微粒，经淋巴管流入静脉系统被输送到脂肪组织和肌肉等外周组织，一部分被氧化，另一部分重新合成甘油三酯储存在组织中（Buhman et al.，2002; Takeuchi et al.，2002; Siddiqi，et al.，2006; 姚晓琳等，2018）。脂肪酶负责水解胃肠中50%~70%膳食脂肪，是防治肥胖的一个关键靶点，而脂肪酶抑制剂可通过降低该酶的活性减少消化器官中膳食脂肪的分解和吸收，进而改善肥胖和高脂血症等代谢性疾病（苗志国，2009）。奥利司他是临床上常用的胰脂肪酶抑制剂，是美国FDA批准的唯一的脂肪酶抑制剂（Kang &Park，2012），能够抑制胰脂肪酶、胃肠道的羧基酯酶和磷脂酶A₂的活性，减慢胃肠道中食物脂肪的水解过程，进而减少饮食中25%~30%的脂肪水解和吸收（Zhi et al.，1999；Benet et al.，2011），进而减少热量摄入，控制体重，降低因肥胖带来的一系列健康问题。因此，本研究选择奥利司他作为阳性药。皱褶假丝酵母脂肪酶和4-NPP 常用于测定化合物的脂肪酶抑制活性（Doolittle &Ben-Zeev，1999；侯成波，2016）。本实验结果表明珠子参叶皂苷部位和20（R）-人参皂苷 Rg₂表现出良好的脂肪酶抑制作用，是潜在的脂肪酶抑制剂。

由于珠子参叶皂苷部位和20（R）-人参皂苷 Rg₂具有较强的脂肪酶抑制作用，并且人参皂苷Rb₃在珠子参叶皂苷部位峰面积最高，因此本研究测定3个样品对脂肪酶的抑制机制。动力学分析发现，珠子参叶皂苷部位、20（R）-人参皂苷 Rg₂、人参皂苷Rb₃对脂肪酶均为可逆性非竞争性抑制，表明该化合物不仅与游离酶结合，还与酶-底物复合物结合，为阐明其脂肪酶抑制机制提供了依据。

分子对接技术是一种模拟生物大分子与配体小分子结合及计算结合强度的手段，通过分子对接的方式来筛选活性分子，从而评价配体小分子与受体的相互作用（欧海亚等，2021；席佳越等，2022）。分子对接结果显示，珠子参叶皂苷成分与ARG337B、ASP331B、ILE248B残基结合可能有助于提高配体的脂肪酶抑制活性。抑制脂肪酶的活性可有效减少脂质的消化吸收，从而降低血脂水平。动物实验发现，珠子参叶皂苷部位能显著降低高血脂小鼠血清中的TG和TC含量，提示珠子参叶皂苷部位可能是通过抑制脂肪酶的活性来发挥降脂作用。

中药中常含有多种活性成分，而中药治疗疾病往往是多种活性成分相互协同作用的结果（王四旺，2008）。珠子参叶皂苷部位的脂肪酶抑制活性强于6个单体成分，可能是珠子参叶皂苷部位多组分之间相互协同作用的结果，也可能是珠子参叶中含有高活性脂肪酶抑制作用的单体化合物尚未被发现。本课题组将在今后的研究中，继续分离珠子参叶的化学成分，进一步阐明化学物质基础及生物活性。

参考文献