CRISPR/Cas9基因编辑是一种在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术。CRISPR基因编辑系统由Cas9核酸酶和引导RNA（single guide RNA，sgRNA）组成。sgRNA的一段（~20 bp）与靶基因互补的DNA序列可以特异性地识别靶DNA，而Cas9核酸酶对靶DNA进行切割，造成双链靶DNA 的断裂，诱发内源性DNA的非同源末端修复机制（Jinek et al.，2012）。DNA修复过程会引起DNA核苷酸的缺失或增加等错配，导致基因移码突变，实现基因敲除。CRISPR/Cas9基因编辑系统也可以对目的基因进行特定修饰（如点突变和基因插入）。例如，在CRISPR基因敲除构建策略的基础上，添加计划插入修饰的DNA片段即可对特定基因插入和替换遗传修饰。

CRISPR/Cas9基因编辑系统因其低成本、构建简单和高效等优点，已经在人类、动物和植物等生物体中被广泛利用，目前已成为基因功能研究和基因定向修饰的一个有效工具（Knott &Doudna2018; Chen et al.，2019）。在植物中的应用表明，CRISPR/Cas9系统不仅可高效诱导产生DNA突变，而且诱导的突变可稳定遗传。该技术可以在基因组水平上对DNA序列进行定点改造以创制优异种质资源。例如：Li等（2023）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将普通烟草中N’基因的抗性核心区域精准替换为野生烟中N’alata基因的对应区域，使得栽培烟草获得了TMV-U1抗性；Qin等（2021）利用CRISPR技术对NIC基因进行编辑产生了尼古丁含量极低的烟草新种质；CRISPR/Cas9基因编辑技术还可用于水稻和番茄等作物的快速驯化（Lemmon et al.，2018; Li et al.，2018; Yu et al.，2021），为加快新品种的创制奠定了基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术在烟草中的成功应用（Schachtsiek &Stehle，2019; Zhang et al.，2023），预示着该技术在未来烟草育种中蕴藏着巨大的潜力。

烟草香味是烟叶及卷烟感官质量的重要指标之一。烟草的香气前体物主要有质体色素、西柏烷和赖百当类菇醇、酚类化合物、氨基酸和还原糖、脂类、生物碱六大类（汪耀富等，2006）。因其内在香气前体合成相关基因的表达不同，不同烟草品种的香气前体种类及含量不同（吕婧等，2014），换言之，烟草香气前体种类和含量很大程度上由烟草本身的遗传因素决定。随着烟草基因组测序的完成，次生代谢产物相关合成酶的基因注释也日趋完善。因此，从基因层面挖掘控制烟草香气前体物的关键基因，通过遗传操作改变相关基因的表达水平可以实现定向培育特定香味的烟草品种。利用CRISPR-Cas9对烟叶香味基因进行高通量靶向突变，将为优异性状新种质的创建、重要功能基因的批量挖掘以及烟草分子设计育种奠定基础。

传统烟草育种工作主要靠多亲本多组合，也就是将不同优良性状的烟草种质资源进行遗传整合，构建优质烟草新品种。但是，这种传统的杂交育种方式不仅耗费大量人力及财力，而且要耗费多年时间。一些优异性状因联锁累赘而无法整合在同一品种里，也在一定程度上限制了优异品种的创制。CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅可以不依赖于遗传杂交对紧密连锁的基因进行同时编辑，还可以突破传统杂交育种无法将连锁优异位点进行整合的限制，因此利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术有望加速烟草香味品质改良。

尽管基因编辑技术已被应用于构建水稻、玉米等突变体库，但尚未应用于烟草基因突变体库的构建。本研究以烟草栽培品种‘红花大金元’为材料，对其100个可能与烟草香味品质相关的功能基因进行靶向设计，构建CRISPR/Cas9载体库并进行共转化，获得了烟草香味品质相关的基因编辑突变体库。基因靶向和脱靶分析表明，利用CRISPR-Cas9技术构建烟草突变库是切实可行的。本研究旨在验证烟草高通量基因编辑技术的可行性，为烟草基因功能研究和新种质创制提供新方法和新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本文以烤烟品种‘红花大金元’为实验材料。

1.2 靶位点序列设计

香味相关候选基因的注释参考烟草基因组数据库NCBI Nicotiana tabacum Annotation Release100（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Nicotiana_tabacum/100/）。利用在线工具CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/; Xie et al.，2017）设计目标基因的特异靶位点，从候选靶位点中选择位于基因编码区前端的靶点。依据靶位点设计和克隆原则设计引物，正向引物为5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTT-3′，反向引物为5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATC-3′。其中，正向引物的20个N是靶位点序列，反向引物的20个N是靶位点序列的反向互补序列，引物退火后的黏性末端恰好与载体Bsa I线性化后的载体形成碱基互补配对。

1.3 CRISPR/Cas9 载体构建方法

以克隆一个基因的CRISPR/Cas9 载体为例：（1）按照上述的引物设计原则，合成相应的正向引物和反向引物；（2）将正向引物和反向引物进行退火反应，形成双链DNA [退火反应体系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4 μL，上下游引物各4 μL（50 μmol·μL^-1），Nuclease-free water 补至20 μL。反应程序： 95℃ 5 min，每8 s 下降0.1℃，直至25℃（约90 min），4℃保存]；（3）将退火反应得到的产物连接到经Bsa I 酶切的CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9/ gRNA上 [连接体系：退火产物2 μL，酶切产物3 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase（400 U·μL^-1）1 μL，无菌水补至20 μL]；（4）连接产物转化DH5α受态细胞，利用菌落PCR筛选阳性克隆（上游引物为U6-F：5′-GATCTCCCAGTCACGACGTT-3′，下游引物为目的基因上靶位点的反向互补序列）；（5）扩繁阳性菌斑，提取质粒，进行测序验证。

1.4 遗传转化

将100个质粒的浓度均调整为l00 ng·μL^-1，每个取1 μL，混匀，然后转化农杆菌GV1301，涂布在含有卡那霉素和庆大霉素的YEB培养基上，黑暗条件下28℃培养3 d。用液体YEB培养基洗脱全部菌落，-80℃冻存，作为后期转化烟草的CRISPR-Cas9编辑菌种。烟草种子播种于育苗培养皿中育苗，待长到4片叶子（约30 d），便可将其移入培养瓶中，于26℃、16 h 光/8 h暗条件继续培养30 d，备用。在超净工作台中，用打孔器将叶片打成直径5 mm大小的圆形叶盘。用40 mL MS液体培养基将YEB培养基活化的CRISPR-Cas9编辑菌种悬浮成菌液（OD600: 0.6~0.8）置于50 mL离心管内。将叶盘转移到盛有菌液的 50 mL离心管内，浸泡侵染10 min，再平铺于MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3 d。之后将叶盘下表面接触培养基，放置于含NAA（0.02 μg·mL^-1）、6-BA（0.5 μg·mL^-1）、羧苄青霉素（500 μg·mL^-1）、卡那霉素（100 μg·mL^-1）的MS培养基上，在（28℃，光照16 h）/（25℃，黑暗8 h）条件下培养，至长出分化芽（约2个月后），切下分化芽（1~2 cm）插入含有羧苄青霉素和卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，分化芽约10 d后出根。

1.5 编辑素材的鉴定

为每个烟草单株编号，每个单株取少许叶片提取DNA。用公共引物 （正向：5′-CTTCAAAAGT CCCACATCGCTTAG-3′； 反向： 5′-TGCAGGACTAG TGGATCAGC-3′）进行PCR，并用正向引物对产物进行测序。通过序列比对，提取相应单株的靶位点序列。根据靶点序列匹配相应的靶基因，并在靶位点两侧设计靶基因的特异性引物，进行PCR扩增，对PCR产物测序。通过序列比对分析相应单株的靶位点是否被编辑。

2 结果与分析

2.1 靶位点设计

根据烟草基因组的功能注释以及文献调研，本研究选择了100个可能参与烟草香气前体物质合成相关的基因（图1），它们编码的蛋白参与次生代谢产物合成，离子吸收转运和信号转导等生物学过程。CRISPR/Cas9编辑技术可用来对特定基因进行编辑以创制功能缺失突变体。CRISPR/Cas9编辑系统由Cas9蛋白和sgRNA组成，其中Cas9负责剪切DNA，而sgRNA前端20个碱基通过碱基互补配对的方式识别靶位点。靶位点的3′端还应包含一个由3个碱基NGG（N代表4种碱基中的一种）组成的原间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）基序。同一个基因通常有多个靶位点可以选择。为保证对特定基因的编辑特异性，本研究利用CRISPR/Cas9设计工具CRISPR-GE为每个基因设计了特异性的靶位点。为确保通过CRISPR/Cas9编辑获得的突变体为功能缺失型突变体，靶位点设计在目标基因靠前的外显子编码区区域（图1）。针对同一个基因存在多个不同转录本情况，靶位点选择在这些转录本的共有外显子编码区域。烟草属于异源四倍体植物，某些基因通常存在一个序列高度相似的同源基因。对一些存在序列高度相似同源序列的基因，设计工具有时无法设计靶向单一基因的sgRNA（单靶点sgRNA）。针对这种情况，本研究选择了可以同时靶向两个同源基因的sgRNA（双靶点sgRNA）。由于靶位点的GC含量比例增加可以提高编辑率，所以当存在多个可选靶位点时，本研究选择了GC含量最高的靶位点（图1）。

2.2 CRISPR/Cas9载体库构建

在本研究所用的基因编辑载体中，烟草花叶病毒的35S启动子用来驱动Cas9基因，拟南芥的U6-26启动子用来驱动sgRNA骨架达。载体上的sgRNA前端预留了一段20 bp的插入序列，该序列包含两个Bsa I酶切位点（图2）。载体经Bas I酶切后，产生两个特异性的黏性末端，可用来连入20 bp的靶位点序列。根据方法中提及的靶位点引物设计原则合成一对包含20 bp反向互补序列的引物，这一对引物经过退火反应后形成的双链DNA包含两个与载体匹配的黏性末端。由于该DNA的两个黏性末端恰好可以与编辑载体的黏性末端完全匹配（图2），所以可以通过T4 DNA酶将片段与载体连接。连接反应后，转化大肠杆菌，抗性板筛选菌斑，PCR扩增鉴定阳性克隆，测序正确后提取质粒。通过该流程，本研究总共构建了100个CRISPR/Cas9质粒，这些质粒按等比例混合后形成了一个CRISPR/Cas9载体库。

2.3 CRISPR/Cas9编辑分析

为了构建突变体库，本研究将上述的CRISPR/Cas9载体库转化农杆菌，然后通过叶盘法转化烟草，再利用抗生素筛选后获得阳性转基因烟草幼苗。由于转基因植物携带了U6-26/sgRNA骨架，因此可以在U6-26启动子区和sgRNA区分别设计上、下游引物并通过PCR测序获取阳性转基因植物的靶位点序列（图3）。根据提取的靶位点序列找到其对应的靶位点及靶基因。在靶位点两侧设计特异性引物，PCR扩增后测序，然后通过序列比对分析判断靶基因是否在靶位点附近被编辑。本研究从172个转基因植株中鉴定到77个不同sgRNA的植株。收获T0代阳性植株的种子后，种植T1代植株，然后从每个sgRNA株系中选择7个单株进行靶位点测序分析。测序结果表明，在61个单靶点sgRNA中，55个有靶向编辑，6个没有靶向编辑；在16个双靶点sgRNA中，13个靶向编辑了双靶基因，1个靶向编辑了2个靶基因的其中1个，2个未靶向编辑靶基因（表1）。sgRNA的靶向编辑率为89.6%（69/77）。

2.4 CRISPR/Cas9脱靶编辑分析

为了评估编辑植株中是否存在脱靶编辑的情况，本研究利用BLAST软件预测了77个sgRNA的潜在脱靶位点。已有研究表明，sgRNA与脱靶位点的碱基错配数量大于1个就可以阻止该位点被编辑，而1个碱基错配仍有较大可能会导致脱靶编辑发生（Naeem et al.，2020），因此本研究只分析了存在1个错配碱基的脱靶位点是否被编辑。在获得的77个sgRNA中，20个sgRNA有1个脱靶位点，1个sgRNA有2个脱靶位点（表1）。在脱靶位点两侧设计特异性引物后进行PCR扩增测序，结果表明只有1个sgRNA的脱靶位点被编辑（图4）。

续表1

续表1

续表1

3 讨论

烟草的香味来源于在烟叶片中合成并累积的香味化学成分。香味相关成分的含量和种类受到相关代谢途径基因的类型及表达水平的控制。受限于烟草种质资源遗传基础方面的研究不足，烟草香味品质相关代谢物合成的基因尚未被大规模鉴定。烟草基因组测序和基因功能注释的完成为烟草香味的研究提供了新动力。本研究利用生物信息学分析获得了100个与烟草香味品质相关的基因，研究这些基因的功能可为后续改善烟草香味品质提供基因资源。

确定某个基因是否与烟草香味相关并对其功能进行解析很大程度上依赖于相关基因突变体的研究。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术日趋成熟，利用该技术研究和创制不同香味品质的烟草种质资源对于烟草工业的可持续发展尤为重要。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术高通量构建突变体库已经应用于水稻（Lu et al.，2017; Meng et al.，2017; Chen et al.，2022）、番茄（Jacobs et al.，2017）、玉米（Liu et al.，2020）和大豆（Bai et al.，2020）等二倍体植物。本研究成功将CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于四倍体植物烟草突变体库的构建。最近，CRISPR-Cas9基因编辑技术已成功应用于油菜突变体库的构建（He et al.，2023），这也是该技术首次应用于十字花科的异源四倍体植物。本研究的编辑对象烟草是茄科的异源四倍体植物，该突变体库的成功构建为在茄科多倍体植物中开展高通量靶向编辑提供了一个成功的案例。

在利用农杆菌共转化获得CRISPR-Cas9基因编辑突变体库的方法中，共转化率、编辑率和脱靶编辑率是研究人员比较关注的问题。本研究结果表明，烟草的共转化率可以达到77%，因此可以获得大多数载体的转基因烟草，这保证了烟草基因突变体库的高覆盖率。烟草的转基因通过愈伤组织转化实现，单次转化的基因编辑率高。本研究证明，共转化多基因编辑载体同样可以实现较高的基因编辑率（89.6%）。CRISPR-Cas9基因编辑技术潜在的脱靶作用是制约其应用的一个主要因素。本研究进行了脱靶位点分析，结果显示，77个sgRNA中只有1个位点产生了脱靶编辑，这说明CRISPR-Cas9对靶位点的识别具有很强的特异性。由于本研究未进行全基因组测序分析，所以不能排除编辑植株仍然存在脱靶编辑的可能性。值得提及的是，在编辑植物中总能筛选到Cas9基因与编辑位点位于不同染色体上的植株，在育种实践中可以通过遗传分离和纯化选择去除转基因标签或脱靶编辑位点。

4 结论

本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了烟草香味相关基因的突变体库，表明CRISPR/Cas9基因编辑技术高通量编辑烟草基因可用于构建烟草突变体库，该方法具有共转化率高、靶向编辑率高和脱靶编辑率低等特点。本研究为烟草香味功能基因的研究提供了遗传资源，为烟草香味重要性状的分子改良提供了种质资源。该技术方法并不是仅限于构建烟草香味品质相关基因的突变体库，而是可用于在烟草中构建研究人员感兴趣的任何性状的基因突变体库，这将加速烟草功能基因的研究。

参考文献