山茶（Camellia japonica）隶属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是我国传统木本观赏花卉 （闵天禄，1992；Gao et al.，2005），俗称耐冬。山茶原产于中国，17世纪中由日本传入欧洲，由此在欧洲、美洲等地开始进行了广泛种植 （陈国方等，2013）。根据国家山茶协会的统计，山茶花的品种已经超过3万个 （Wang et al.，2021）。观赏山茶种质的地理起源复杂，并且存在种间杂交，这使得其染色体倍性存在较大差异（Tanaka et al.，2006；Hembree et al.，2019）。在山茶科里，山茶属与核果茶属的基本染色体数都是1n=1x=15，但是其他属的基本染色体数量并不完全一致，如紫茎属的基本染色体数为1n=1x=15或者1n=1x=17，福兰茶属、大头茶属、木荷属的基本染色体数为1n=1x=15或1n=1x=18（Hembree et al.，2019）。山茶属植物的倍性存在多种多样的变异，从三倍体到十倍体都有被报道，其中六倍体为较常见的多倍体（Kondo，1977；Hembree et al.，2019）。

植物染色体倍性的变化会影响到许多性状（Serrano-Mislata et al.，2015）。比如，来自不同倍性的杂交种子发育后，可能会引起胚乳发育失败，最终产生生活力低或者没有活力的种子；另外，奇数倍性的植物在生育力上不及偶数倍性的作物（Kondorosi et al.，2000）。产生多倍体变异的原因包括自然变异和诱变变异等，其中诱变变异又可以分为物理诱导和化学诱导。目前，大多数人工诱导多倍体的方法是用化学试剂（包括秋水仙素、氟乐灵、氨磺灵等）对正在产生细胞分裂的植物器官、组织、细胞等进行处理，诱导其产生多倍体（彭尽晖等，2004；程红英，2010）。秋水仙素在植物多倍体诱变上被应用得最为广泛。秋水仙素主要提取于百合科秋水仙（Colchicum autumale）的种子和鳞茎，具有较强毒性（彭尽晖等，2004）。秋水仙素的主要作用机制如下：通过与有丝分裂细胞接触，秋水仙素可以与微管蛋白异二聚体结合，导致有丝分裂中期的染色体不能在赤道板上进行排列，影响染色体的分布（彭尽晖等，2004）。

组培再生过程中，培养条件和介质因素导致体细胞变异、染色体结构重排、倍性变化等情况，这非常普遍（Leite et al.，2019）。Phillips等（1994）研究发现，不同培养基的组培再生条件下，染色体畸变、非整倍体和多倍体经常发生在体外再生体中。在马铃薯、小麦、水稻等农作物中，体细胞无性系等植株可以出现染色体畸变、DNA甲基化、基因突变等多种方式（韦彦余等，2004）。在山茶属植物中开展组培扩繁体系具有应用意义，然而组培条件下不同倍性种质的染色体完整性研究还比较缺乏。

山茶属种质有较复杂和高频率的染色体倍性变化，二倍体、四倍体、六倍体常有出现，那么不同倍性的材料在组培条件下能否维持完整倍性，是否会发生倍性的变化还值得研究。

因此，为明确山茶属观赏材料的倍性情况，本试验参考了前人在山茶属植物中建立的再生体系（刘海英，2011；吴斌等，2013），研究不同倍性材料之间形态学上与不同组织培养阶段下的染色体的倍性变化情况，拟探讨以下问题：（1）收集到的10个山茶种质的倍性情况；（2）秋水仙素处理后山茶染色体加倍的浓度和时间条件。本研究结果通过对山茶染色体倍性的检测分析了不同山茶种质的倍性情况，并探索了山茶染色体变异诱导的最适条件，为多倍体育种的理论奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和采样

所使用的山茶种质采自中国林业科学研究院亚热带林业研究所山茶种质资源圃以及金华山茶物种园，采样时间为2021年7—8月，样品类型为嫩叶、花芽等组织（表1）。具体的种质信息如下：单体红山茶（Camellia uraku）、浙江红山茶（C. Chekiangoleosa）、滇山茶（C. reticulata）、大花红山茶（C. magniflora）、峨眉红山茶（C. omeiensis）、全缘红山茶（C. subintegra）、山手（C. japonica ‘Shanshou’）、南山茶（C. semiserrata）、尖萼红山茶（C. edithae）、金蝶飞叶（C. japonica ‘Jindiefeiye’）。

1.2 山茶种质愈伤组织的培养

前期采集获得了10种山茶种质的样品，经过自来水冲洗和外植体消毒后，使用MS-D2培养基诱导愈伤组织。MS-D2培养基配方如下：琼脂6.5 g·L^-1、蔗糖30 g·L^-1、MS培养基粉末4.43 g·L^-1、NAA 0.5 mg·L^-1、2，4-D 0.5 mg·L^-1、6BA 1 mg·L^-1、椰汁50 mL·L^-1。外植体消毒流程如下：使用75%酒精浸泡并摇动外植体，使充分接触2 min；用灭菌后的纯水冲洗2次后，使用5%次氯酸钠消毒10 min；剥离外部已褐化的外层苞片后、切开并接种进培养基。经暗培养约1个月后，待脱分化的愈伤组织长到约0.5 cm × 0.5 cm大小后，将已褐化的原外植体切除后，移入组织培养瓶中进行光照培养，条件为12 h光/12 h暗、光照强度4 000 lx、温度（25±2）℃。

1.3 山茶种质愈伤组织的流式细胞仪分析

（1）取适量愈伤组织（0.1~0.2 g）放入3.5 cm培养皿中，培养皿中放入2 mL的细胞裂解液（Tris 200 mmol·L^-1、MgCl₂ 4 mmol·L^-1、Triton 0.5%，pH 7.5），用锋利的刀片切成小块后冰上放置约15 min。（2）使用移液枪吸取塑料培养皿中的上清液，将上清液经过孔径40 μm的尼龙滤膜过滤，转移至2 mL的圆底塑料管中，并做好标记。根据滤液体积，加入1/100体积的PI染料（100 mg·L^-1），轻轻混匀后用锡箔纸封闭，置于冰上保存至上机检测。（3）使用BD Accuri C6流式细胞仪对山茶愈伤组织以及诱导后的组织进行倍性测量，使用FL2-A作为x轴，SSC-H作为y轴对测定值进行分析。

注: RISF. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所。

Note: RISF. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry.

1.4 山茶组织秋水仙素处理和培养

依据秋水仙素设定的处理浓度，配置CS4培养基（琼脂6.5 g·L^-1、蔗糖30 g·L^-1、MS培养基粉末4.43 g·L^-1、TDZ 1 mg·L^-1、PAA 15 mg·L^-1、NAA 0.3 mg·L^-1、椰汁50 mL·L^-1），并对耐冬愈伤组织进行培养。秋水仙素浓度分别为10、20、30 mg·L^-1，处理时间为10、15、20 d，处理完成后转入不含秋水仙素的CS4培养基中，利用流式细胞仪测定DNA含量并估算染色体倍性。为了快速检测处理效果，倍性检测首先采用混测法，即将5~6个愈伤组织混合检测，根据倍性变化结果对每个愈伤组织样本进行单个测定，每个样品重复3次，用于数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 建立10个山茶种质愈伤组织和组培再生过程

山茶种质的外植体经过约30 d的诱导和继代后出现愈伤组织，获得愈伤组织的山茶种质包括单体红山茶、浙江红山茶、大花红山茶、滇山茶、峨眉红山茶、尖萼红山茶、金蝶飞叶、南山茶、全缘红山茶、山手（表1）。其中，全缘红山茶的愈伤组织较为松散，其他山茶种质培育的愈伤组织较为紧密且获得的愈伤组织未出现明显的死亡与褐化等情况，说明现有体系能够高效获得愈伤组织（图1），其中FCM-1代表诱导的初代愈伤组织，FCM-2为愈伤继代培养后阶段，FCM-3为愈伤组织转入组织分化培养（CS4培养基）阶段，之后通过2~3次继代（30~50 d）获得部分分化的愈伤组织或者芽状组织。

2.2 山茶属植物种质不同培养阶段的染色体倍性检测

根据实验室前期结果，以遗传稳定的二倍体耐冬为对照，通过流式细胞仪分析检测10个山茶属种质材料，根据估算其核内DNA的含量推断染色体倍性（表2）。结合图1所示的组培再生过程，分别选取不同培养阶段的组织（FCM-1、FCM-2、FCM-3）开展流式细胞仪分析。由表2可知，不同培养条件下的染色体DNA含量在同一个材料当中变化细微，其倍性没有发生明显变化；检测的山茶属种质组织材料包含6个二倍体、2个四倍体、1个六倍体、1个十倍体。这说明所选用种质存在较大的倍性变化，但是在当前组培再生条件下其倍性保持稳定。

2.3 耐冬多倍体诱导

随着处理浓度和处理时间的增加，秋水仙素会使植物愈伤组织失去生命活力（张焕玲等，2008）。为了探究秋水仙素处理对山茶组织染色体的影响，我们利用组培再生体系，设置了耐冬秋水仙素处理条件（表3）。由表3可知，在浓度10 mg·L^-1条件下致死的个体数量未达到半数，达到半致死的天数约为48 d；在浓度20 mg·L^-1条件下处理10 d后约有预期效果。因此，秋水仙素在浓度20 mg·L^-1培养基下处理10 d被选为处理的最适合条件，进而开展耐冬的处理研究。

2.4 秋水仙素处理耐冬组织的倍性检测

使用流式细胞仪，测定了经秋水仙素处理（浓度20 mg·L^-1，处理10 d）的56个独立愈伤来源的分化组织（其中含有4个芽组织）的倍性变化情况（图2：A）。结果发现，秋水仙素诱导对耐冬的倍性产生了显著改变，除了少数的愈伤组织为二倍体，大部分愈伤组织和芽组织中倍性呈现出非整倍性的梯度性变化（图2：B），其中最小倍性为1.2倍，最大倍性为3.2倍。这说明秋水仙素处理造成了耐冬染色体倍性的不稳定变异，但是整倍性加倍或者减少的事件出现的情况较低。

3 讨论与结论

3.1 山茶属植物组培再生和染色体倍性维持

在染色体倍性的鉴定中，与核型鉴定方法相比，流式细胞术由于准确性较高、检测速度较快等特性被广泛推广，适用于大规模组织样品的倍性检测分析，有利于高效获得染色体倍性的变化信息（瑞菲尔·努纳兹等，2005；李靖等，2008）。山茶属植物的组织中含有多种次生代谢物质，其中单宁化合物在流式分析过程中能够跟荧光染料（如碘化丙啶）结合，造成较强的背景信号（Huang et al.，2013）。在山茶属植物中，通过优化细胞核裂解液和选取次生代谢物含量低的幼嫩组织，流式细胞分析通常能解决背景信号的问题（Huang et al.，2013）。但是，一些山茶属植物材料（油茶、茶梅等）的单宁类物质含量较高，使得在流式分析的重复性不高（贾文庆，2015）。Weber等（2008）研究发现，植物愈伤组织均为未分化的、较为幼嫩的细胞团，其中次生代谢物含量较少，有利于开展流式细胞仪检测。本试验使用脱分化的愈伤组织进行流式细胞仪分析，能获得重复性较高的细胞核分离效果，增强了检测的稳定性。因此，本研究方案减少了杂质对山茶倍性测定的影响，避免了山茶新鲜组织中单宁等物质的背景荧光，提高了实验的准确性与可重复性。

Syeed等（2021）研究表明组织培养及其再生的过程能够造成染色体的断裂、重组等，从而影响染色体倍性的变异。如Ali等（2017）在香芹（Coriandrum sativum）中的研究发现，基因组大小在体胚诱导组织与种子萌发苗之间存在较大变异，说明培养基条件能够影响基因组的稳定性。本研究发现，在常规的组织再生过程中，不同倍性的山茶属种质的染色体倍性相对稳定，这保障了研究方案中不同处理对染色体倍性的连续性研究。但是，不同的组培条件对山茶属基因组稳定性的影响研究还不充分。山茶属植物组培再生途径周期较长，激素的组成、培养时间等条件对染色体倍性的维持和变化的研究还有待进一步深入。

3.2 秋水仙素处理山茶属植物后染色体倍性的变化

在观赏植物的染色体加倍的报告中，使用秋水仙素对植物进行诱导的成功率最高（Manzoor et al.，2019）。例如，在与山茶属近缘的杜鹃花（Rhododendron fortune）中，利用0.1%秋水仙素处理24 h就能高效地诱导出多倍体组织（Mo et al.，2020）。本研究发现，山茶属植物对秋水仙素具有较高的抵抗性，在30 mg·L^-1的培养基中其半致死的时间约为1个月。本试验使用固体培养基对山茶进行了培养，研究表明秋水仙素的处理能够使再生组织的染色体倍性发生显著变化，但是极少（约为1%）出现类似整倍性的变化。本研究发现，秋水仙素处理后的山茶组织呈现频繁的非整倍体细胞。尽管类似的结果在其他植物中也有发现，如柑橘（Gmitterjr et al.，1991）、葡萄（Kara et al.，2019）等。Park等（2016）研究指出，由于非整倍体植物通常表现出发育异常、不育或致死性，因此很少评估非整倍体植物的经济用途。Park等（1999）通过使用未成熟种子的培养和随后的胚培养，从184个不同的三倍体杂交葡萄藤之间的各种杂交中回收了5个染色体数目在51~59之间的非整倍体植物。在山茶属植物中的非整倍体出现得较多（56个样品中有38个组织的倍性在1.5~2.5倍之间），推断其形成原因如下：（1）由于秋水仙素处理对组培不同类型细胞中纺锤丝的作用存在特殊性，山茶属植物组培条件下细胞处于不均匀等分裂状态，它抑制纺锤丝的效果不尽相同，因此产生的并不是完整的多倍体，并存在染色体缺失、染色体嵌合等情况，造成倍性检测的结果不均一；（2）山茶属植物对秋水仙素的响应存在差异，尽管前期实验设计中的秋水仙素浓度对愈伤组织的生长抑制作用不明显，但是处理浓度及作用时间可能在细胞增殖过程中存在敏感性差异。另外，本研究发现11个组织样品（19.6%）产生了低于1.5倍性的特异现象，我们推测这可能是由于在有丝分裂过程中，秋水仙素的处理导致细胞中染色体加倍过程出现障碍，因此造成丢失了部分染色体。综上结果，秋水仙素对山茶属植物处理条件（如秋水仙素的处理浓度、处理时间、处理部位等）需要进一步优化，以达到最佳的整倍体诱导的效果。

本实验通过探索组培条件下山茶种质的维持与变化情况，测试了使用秋水仙素对山茶种质资源的加倍的最适条件，为今后探索山茶种质资源的加倍提供了基础，并为山茶多倍体的育种打下了基础。

参考文献