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灰树花（Grifola frondosa），又名贝叶多孔菌、舞茸、栗茹、栗蘑、云蕈，隶属于蘑菇纲（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），灰树花孔菌科（Grifolaceae），树花孔菌属（Grifola）。最新研究的观点（谢雪娇等，2024），产自中国的灰树花学名为灰树花（Grifola albicans f. huishuhua）。灰树花子实体肉质、脆嫩，呈珊瑚状分枝，多生长在阔叶树的树桩或树干周围。灰树花中含有丰富的天然活性成分，如多糖（糖蛋白）、核苷类、多酚、氨基酸等活性物质，其中灰树花多糖的药理活性研究较为深入（赵小坤等，2023）。灰树花具有抗肿瘤（Adachi et al.，1987）、诱导干扰素合成（熊雯宇等，2022）、改善人体免疫功能（张婷，2021）及抗病毒（肖建勇等，2022）等多种药理作用。此外，灰树花营养丰富、味道鲜美，野生灰树花在很久以前就被采撷食用（徐铮奎，2010），现作为一种药食两用真菌，深受人们喜爱，被称为“食用菌之王”（Chen，2015）。
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灰树花深层发酵菌丝体具有与子实体相近的营养组成（周昌艳等，2001）和药理作用（张医芝，2017），可替代子实体作为产品原料。目前，国内对灰树花菌丝体的研究主要集中在不同发酵液成分对菌丝体生长的影响（钟敏，2018）、活性成分提取工艺优化（黄忠等，2016；钟敏等，2017）、转录组差异表达（王伟科等，2016）等方面，关于灰树花菌丝体生长过程中代谢物途径的研究尚未见相关报道。代谢物是菌丝体药理活性的物质基础，同时不同发育阶段差异代谢物种类和表达在不断变化，厘清灰树花菌丝体在不同培养时间代谢物的变化将有利于活性物质的适时采收和菌种的维护。
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代谢组学是一种研究微生物代谢产物差异及代谢机理的重要方法，同时，因其具有灵敏度高、精密度好等特点，而在大型真菌领域越来越受重视（郑焕等，2023）。代谢组学研究方法在大型真菌中的应用，主要集中在研究大型真菌在不同生长时期或受到某种刺激前后所有小分子代谢产物的相应变化，进而揭示多种大型真菌的代谢规律（Zhang et al.，2019；Li et al.，2019；Wangsawat et al.，2021）。Sato等（2017）对不同木屑培养基中两种灰树花子实体进行CE-MS代谢组学分析，揭示了两种培养基中子实体初级代谢物的变化情况；雷露等（2020）运用UPLC-QTOF-MS结合多变量统计分析的方法，探讨了添加天麻苦荞复配液对灰树花菌体代谢产物的差异，并发现添加天麻苦荞复配液有助于增加灰树花胞外多糖产量和提升发酵液的营养价值与功能特性。本研究以培养10、20、30 d的灰树花菌丝体为研究对象，采用非靶向代谢组学（HPLC-MS/MS）分析方法，研究灰树花菌丝体不同生长阶段的代谢产物，探讨灰树花菌丝体不同生长阶段代谢物变化情况，以期为灰树花菌丝体代谢产物的开发和生产提供理论参考。
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1 材料与方法
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1.1 供试菌株
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子实体采自广西姑婆山自然保护区壳斗科植物林下（图1），分离纯化后得到菌株，再将测试的灰树花菌株接种于PDA培养基培养15 d，进行菌株的活化。
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1.2 培养基配方
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GPC固体培养基（g·L-1）配方：20 g葡萄糖，6 g蛋白胨，10 g玉米浆，15 g琼脂，0.5 g硫酸镁，蒸馏水1 000 mL。培养基于锥形瓶中搅拌均匀，高温灭菌，备用。
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1.3 方法
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1.3.1 培养基的制备
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采用平板培养法，配制的培养基均为同一批次药品、试剂以及相同的培养基配方且为同一批次分装，每组设置3个重复。用直径1 cm的打孔器打孔取同一来源的菌丝块接至GPC培养基，3个重复于同一培养环境下（同一温度、湿度等）培养，确保用于测试的菌株除培养时间不同外，其余培养条件保持一致。
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1.3.2 菌丝体鉴定
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分别夹取培养10、20、30 d培养基内部干净的灰树花菌丝体，放入1.5 mL的离心管中，按照植物基因组DNA快速提取试剂盒（康维世纪生物科技股份有限公司，CW0531M，江苏）的说明书进行操作，完成DNA提取。PCR扩增ITS片段（ITS4/ITS5），PCR程序：94~95℃预变性4~5 min；94~95℃变性40~60 s，52~54℃退火40~60 s，72℃延伸1.0~1.5 min，33~35 个循环；72℃延伸10 min，15℃保存。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，将测序的结果在NCBI上比对DNA序列，根据输出的比对结果，初步确定供试菌株所属的物种，排除样品污染。在NCBI数据库中选择灰树花及同属不同种的序列，用 MEGA 11中的Clustal X程序进行多序列比对，用Neighbor-joining方法构建系统发育树。
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1.3.3 代谢组学分析
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样品制备、提取物分析、代谢物的鉴定、定量分析和生物信息学分析，均由生工生物工程（上海）股份有限公司（网址：https://www.sangon.com/）严格按照标准程序进行操作。
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供试样品的制备：参考周嫒婷等（2023）和何亚琼等（2020）的方法，从第10天开始每隔10 d取样1次直至培养到30 d，每次取3个生物学重复。分别称取适量样品于2 mL离心管中，加入钢珠；加入1 000 μL 50%甲醇水（4℃保存），充分混匀后置于2 mL适配器里，浸入液氮充分研磨至粉末状；将样品置于4℃，12 000 r·min-1 离心10 min；吸取上清液，浓缩干燥，准确加入300 μL 50%2-氯-L-苯丙氨酸（4 mg·mg-1）溶液复溶样品，取上清液过0.22 μm膜进行过滤，得供试样品。
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液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 mm × 150 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA，USA）；色谱条件：0.25 mL·min-1流速，40℃柱温，进样量2 μL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水（A2），负离子模式，流动相为乙腈（B3）和5 mmol·L-1甲酸铵水（A3）。梯度洗脱程序：0~1.0 min，2%B；1.0~9.0 min由2%B升至50%B；9.0~12.0 min，由50%B升至98%B；12.0~13.5 min，保持98%B；13.5~14.0 min，由98%B降至2%B；14.0~20.0 min，保持2%B。
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质谱条件：Orbitrap Exploris 120质谱检测器（Thermo Fisher Scientific，USA），电喷雾离子源（ESI），用正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325℃，以分辨率70 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围100~1 000 m/z，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30 eV，二级分辨率为17 500，采集信号前8的离子进行碎裂，同时采用动态排除法去除无必要的MS/MS信息（Trygg et al.，2002）。
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1.4 数据分析
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运用Proteowizard软件包将原始质谱下机文件转换为mzXML文件格式，利用R软件进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表。主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）使用R软件包Ropl进行分析；物质的鉴定利用公共数据库HMDB、massbank、LipidMaps、mzcloud、KEGG及自建物质库。根据统计检验计算P值、OPLS-DA降维方法计算变量投影重要度（VIP值）；统计学意义（P值）使用t检验来计算，当P值＜0.05和VIP值＞1时，认为代谢物分子具有统计学意义。
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2 结果与分析
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2.1 灰树花菌丝体鉴定分析
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将自测序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，结果显示培养10、20、30 d的菌丝体比对结果靠前的均为灰树花。将所取灰树花菌丝体样品（GPS10 d、GPS20 d、GPS30 d）与树花孔菌属内物种ITS序列构建系统发育树，获得的系统树如图2所示。由图2可知，3个培养时间的菌株与灰树花菌株聚为一支，支持率为100，表明所培养的菌丝体为灰树花菌丝体。
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2.2 灰树花不同生长时期菌丝体代谢物主成分分析（PCA）
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为初步分析灰树花菌丝体不同生长时期代谢物积累的差异，对灰树花菌丝体代谢物进行主成分分析（PCA）。PCA中，正离子和负离子模式下R2分别为0.515和0.517，均大于0.5，说明实验建立的PCA模型稳定，可以用于代谢差异分析。正负离子模式下，菌丝体培养10、20、30 d由主成分1（PC 1=35.1%/30.6%）和主成分2（PC 2=16.4%/21.1%）建立的得分图上有分离趋势，说明不同培养时间的代谢产物存在一定差异。其中，培养10 d分别与培养20、30 d的菌丝体样本差异较大，而培养20 d与30 d样本差异较小，并且存在部分重叠现象，但总体分离趋势仍然比较明显（图3）。因此，我们推测这是由灰树花菌丝体在培养20 d和30 d时体内代谢物变化不明显而造成。
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图4为差异代谢物的聚类热图，可以用来推测灰树花菌丝体已知或未知代谢物的生物学功能。由图4可知，在正离子模式下，培养20 d的3个生物学重复分别与培养10、30 d聚成两个分支，不同培养时间的菌丝体代谢物组间差异不明显，但是这种趋势仅限于培养时间相近的组，如培养10 d与20 d、20 d与30 d，培养时间不相近的组之间的差异较为明显。阴离子模式下，培养10 d聚为一个分支，其他培养时间聚为一个分支，与PCA得分图推测一样。
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2.3 灰树花菌丝体代谢物正交偏最小二乘法（OPLS-DA）分析
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为了消除随机误差，采用OPLS-DA法进一步分析培养10、20、30 d菌丝体的差异代谢产物（Want et al.，2013），结果在正离子和负离子模式下R2Y（cum）和Q2（cum）都接近于1，表明本研究的OPLS-DA模型可以展示灰树花菌丝体不同培养时期代谢产物的差异和区别。
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利用OPLS-DA对鉴定出的代谢物进行分析，结果（图5）显示，消除无关的组内误差和与研究目的无关的随机误差后，其组间分离的效果明显优于PCA。除培养20 d外，组内分布集中，组内样本重复性较好。此外，OPLS-DA模型的置换检验显示，Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴，正离子模式R2（0，0.96）、Q2（0，0.13），负离子模式R2（0，0.96）、Q2（0，0.13），从左到右的蓝色Q2点都低于最右的原始绿色R2点且Q2＜0，说明所建立模型可靠性良好，不存在过拟合现象。
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2.4 灰树花菌丝体差异代谢物鉴定
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利用HPLC-MS/MS技术对灰树花不同培养阶段的菌丝体化学组分在正、负离子模式下进行分析，经鉴定的灰树花菌丝体在不同培养时期中正离子模式下有31 382个差异代谢物，负离子模式下有26 659个代谢物。3个培养阶段的灰树花菌丝体共筛选出584种差异代谢物，根据标样的质谱信息，对差异化合物进行了鉴定分析（图6），按一级分类分属于42个类别（表1）。
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2.5 差异代谢物分析
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2.5.1 不同培养时间共有差异代谢物分析
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由表1可知，不同培养时间的共有差异代谢物中，其他类的组分最多，有108种；在剩余的组分中，羧酸及其衍生物的种类最多，有104种；紧随其后为脂肪酸（68种）、有机氧化合物（51种）、苯和取代衍生物（31种）、类固醇和类固醇衍生物（29种）等。由此可见，灰树花菌丝体中含有丰富的羧酸及其衍生物（氨基酸类化合物），并且培养前期氨基酸的种类比培养后期的种类多。除此之外，核苷酸及其衍生物、有机氧化合物、类固醇和类固醇衍生物、脂肪酸、苯和取代衍生物等化合物的种类随培养时间的延长呈现下降趋势，说明培养前期含有更加丰富的代谢物。对于次生代谢产物如黄酮类、酚类和生物碱类物质的种类在菌丝体培养各个时期保持相似水平。
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2.5.2 培养10 d与培养20 d间差异代谢物分析
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10d vs 20 d比较组中共鉴定出159种差异代谢物，菌丝体培养10 d较培养20 d含量高的有69种，约有25种初生代谢产物的化学组分含量高于培养20 d，含量比较高的主要有腺苷酸、维生素B6、维生素B5、维生素B1、胸腺嘧啶、L-苏氨酸、鸟氨酸、哌啶酸等。其余大部分化学组分主要为次生代谢物，其中表达量比较高的主要有海藻糖、叶辛木素、异胆酸、Alprazolam和驱蛔素等。其中，维生素B5、D-半乳糖、维生素B3、胸腺嘧啶、羟基丙酮酸等差异代谢物在此时显著表达（图7）。
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培养20 d相对含量高于培养10 d有90种代谢物，约有21种初生代谢物含量高于培养10 d，相对含量比较高的有4-羟基脯氨酸、维生素B3、维生素B8、D-丝氨酸、瓜氨酸、脱氧胞苷、L-丙氨酰-D-谷氨酰胺、N-甲基酪胺、L-亮氨酸；剩下主要为次生代谢物，主要包括异烟酸、曲酸、鲱油酸、玉红碱、烯虫酯、橄榄苦甙、顺乌头酸、莽草酸、千里光碱等化合物。其中，4-羟脯氨酸、N-甲基酪胺、脱氧胞苷、雄酮、D-丙酰基丝氨酸在此时显著表达（图7）。
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2.5.3 培养20 d和培养30 d间差异代谢物分析
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培养20 d vs 30 d比较组中共鉴定出47种差异代谢物，培养20 d较培养30 d含量高的有27种，包括4种初生代谢物（β-酪氨酸、β-丙氨酰-L-精氨酸、变肾上腺素）和部分次生代谢物（Alprazolam、尸胺、橄榄苦甙、亚麻碱、N-甲基酪胺、亚麻酸等）。其中，3-氨基-4-甲基羟基苯甲酸、Neostigmine、甘胆酸、N1，N8-Bis（4-coumaroyl）spermidine、β-酪氨酸等在菌丝体培养20 d时显著表达。
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其余20种成分在培养30 d时相对含量比培养20 d高。初生代谢物有维生素B5、γ-L-谷酰基-D-丙氨酸，次生代谢产物包括可可碱、别胆酸、氧化石竹烯、金合欢醇、糠酸乙酯。高异柠檬酸、顺式-已二烯二酸、维生素B5、二磷酸胞苷等在培养30 d时显著表达（图8）。
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2.5.4 培养10 d和培养30 d间差异代谢物分析
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培养10 d vs 30 d比较组中共鉴定出165种差异代谢物，培养10 d菌丝体代谢物相对含量比培养30 d高的有77种，包括异亮氨酸、γ-谷氨酰丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、前列腺素G2、L-苯丙氨酸、β-酪氨酸、L-甲硫氨酸等15种初生代谢物以及甘胆酸、染料木黄酮、橄榄苦苷、密叶辛木素、浅蓝菌素、N-甲基酪胺、Alprazolam、尸胺等次生代谢物，其余88种成分在培养30 d时相对含量较高，含量最高的3种代谢物为前列腺素C1、氧化型谷胱甘肽、尿苯丙酸。其中，尸胺、3-氨基-4-羟基苯甲酸、Neostigmine、Alprazolam等代谢物在培养10 d时显著表达，12-氧代植物二烯酸、雄酮、高异柠檬酸等代谢物在培养30 d时显著表达（图9）。
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各培养阶段仅有少部分差异代谢物为初生代谢物，约有75%的差异代谢物为次生代谢物。由此可见，次生代谢产物是灰树花菌丝体培养过程中的主要组分。培养10 d初生代谢产物如维生素B6、维生素B5、维生素B1、胸腺嘧啶、苏氨酸、鸟氨酸等氨基酸类和维生素类物质显著表达，但随着菌丝体的成熟，总的表达量有所降低。培养20 d橄榄苦甙、甘胆酸、N-甲基酪胺、雄甾酮显著表达；培养30 d含量高的化学组分主要集中在次生代谢物方面，如咖啡因、别胆酸、可可碱、金合欢醇等。
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糖类作为灰树花菌丝体不可忽略的有效成分之一，研究发现其在培养前期含量较高，鼠李糖、麦芽三糖、景天庚酮糖、D-半乳糖、海藻糖、D-木糖醇6种糖类物质仅在10 d vs 20 d比较组检测到且在10 d表现上调，说明培养前期糖类显著表达。
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2.6 KEGG通路富集分析
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将组间有KEGG ID的差异代谢物与KEGG数据库进行匹配和代谢富集分析，可获得差异代谢物参与的通路。10 d vs 20 d比较组中富集到163条通路，其中差异显著（P＜0.05）的代谢通路共49条（图10：A）。在显著富集的前20条通路中有7条氨基酸代谢通路显著富集（图10：B），分别为氨基酸的生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，β-丙氨酸代谢，组氨酸代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，赖氨酸降解，精氨酸生物合成；其余的代谢通路分别有ABC转运蛋白，植物次生代谢产物的生物合成，蛋白质消化吸收，亚油酸代谢，2-氧羧酸代谢，辅因子的生物合成，鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生生物碱的生物合成，癌症的中心碳代谢，矿物质吸收，泛酸和辅酶a的生物合成，代谢通路。
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20d vs 30 d比较组中共富集到81条通路（图10：C），其中差异显著的代谢通路有12条（图10：D），包含氨基酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，β-丙氨酸代谢，3条氨基酸代谢通路显著富集，其余通路为植物次生代谢产物的生物合成、代谢途径、组氨酸和嘌呤衍生的生物碱的生物合成、辅因子的生物合成、不同环境下的微生物代谢、咖啡因代谢、ABC转运蛋白、半乳糖代谢、初级胆汁酸生物合成。
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10d vs 30 d比较组中共富集到137条通路（图10：E），其中差异显著的代谢通路有26条，在显著富集的前20条通路中有5条氨基酸代谢通路显著富集（图10：F），分别为氨基酸的合成代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢；其余的代谢通路分别有亚油酸代谢，鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生生物碱的生物合成，植物次生代谢产物的生物合成，植物激素的生物合成，α亚麻酸代谢，辅因子的生物合成，嘧啶代谢，莨菪烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，2-氧羧酸代谢，由组氨酸和嘌呤衍生的生物碱的生物合成，癌症的中心碳代谢，谷胱甘肽代谢，代谢途径，玉米素生物合成等代谢通路。
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3 讨论与结论
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3.1 灰树花菌丝体不同生长时期差异代谢物
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通过非靶向代谢组学技术对培养10、20、30 d的灰树花菌丝体内差异代谢物进行分析。我们共筛选出42类584种差异代谢物。在灰树花菌丝体培养10 d时，氨基酸、维生素、糖类以及核苷酸类化合物的种类和含量随培养时间的延长呈下降趋势。由于含氮化合物主要从培养基中引入，以菌丝体蛋白、核酸、游离氨基酸或几丁质的形式积累在营养菌丝体中，此时氨基酸表达量增加，因此培养早期的菌丝体可能是提取游离氨基酸成分的最佳时期。随着菌丝体的成熟游离氨基酸可能会合成其他含氮成分，导致表达量下降（Terashita et al.，1984）。维生素具有促进菌丝体生长（凌亚飞，2000；贺晓龙等，2014）、减缓细胞凋亡和修复损伤的作用，还具有提高菌丝体通透性（张函等，2021）、抑制微生物生长（Grange et al.，2009；Yan et al.，2022）的作用，是细胞正常生命活动必不可少的重要成分之一。
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糖类和核苷酸类化合物可能具有氧化供能和抗胁迫的作用。海藻糖、AMP分别为本研究菌株糖类和核苷酸的主要成分，与Sato等（2017）研究在不同含锯末培养基上培养的两种菌株子实体的差异代谢物结论相似。Kong等（2012）研究表明，白灵侧耳经外源海藻糖处理后，在高温条件下受到损伤明显降低。本研究的灰树花菌丝体并没有受到高热、干燥胁迫处理，但在培养前期海藻糖含量持续升高，可能是培养时外界温度过高导致菌丝体受到一定程度的氧化胁迫所致。Brunton和Gadd（1989）研究发现，加入一定浓度的核苷酸有助于酵母菌丝体的萌发，AMP的积累可能与促进菌丝体的发育、氧化供能有关。
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灰树花菌丝体在培养20 d时产生或积累了多种对人体有益的次生代谢物，如橄榄苦甙、甘胆酸、N-甲基酪胺、Alprazolam。橄榄苦甙作为一种天然提取物，具有较强的抗氧化、抗炎和抗菌作用，与化学合成抗生素一样，是治疗和预防手术部位感染的替代和辅助药物。橄榄苦甙可以安全有效地治疗和预防铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌手术部位感染，特别是在手术后的早期和后期（Bayaktar &Okyay，2023）。N-甲基酪胺是由L-酪氨酸脱羧和N-甲基化而形成，已被证明可通过对胃泌素和胰腺分泌物的刺激作用增强食欲和食物的消化，是一种良好的膳食补充剂（Stohs &Hartman，2015）。据报道，甘胆酸可以抑制炎症并激活法氏体X受体表达（Ge et al.，2023），Alprazolam有抗焦虑、抗抑郁、镇静、催眠、抗惊厥及肌肉松弛等作用，后续可进一步分离纯化这些化合物，充分提高灰树花的药用价值。
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培养30 d的菌丝体中含有多种与产生香气有关的物质，如氧化石竹烯、金合欢醇、糠酸乙酯等。糠酸乙酯能产花果香香韵及蘑菇似的香气（赵玮等，2012）。据研究，金合欢醇和氧化石竹烯是许多芳香植物香味的贡献者之一（张美芬等，2023），推测氧化石竹烯、金合欢醇和糠酸乙酯可能与灰树花菌丝体产生特殊香味有关，值得关注的是氧化石竹烯和金合欢醇本身还具有多种抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等活性（袁媛，2019；修志儒，2023）。
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本研究发现，培养不同时间的灰树花菌丝体代谢物相对含量呈先上升后下降的趋势，代谢物数量整体呈下降趋势。这与王倩（2016）和方亮（2022）等不同培养时间下的粉被玛利娅霉和暗褐网柄牛肝菌菌丝体代谢物数量变化略有不同。我们推测可能是前期培养基营养充足，菌丝体代谢活跃、生长旺盛，产生的代谢产物数量增加，而培养20 d后由于培养基营养减少，代谢产物为了获取生长能量通过代谢途径转化成其他物质，导致培养中后期代谢产物数量比培养10 d少。此外，本实验设计的培养时间间隔差距过大，缺乏菌丝体培养前期和后期的实验数据，未能很好地体现灰树花菌丝体培养各个时期的代谢过程，后期应该将培养时间细化或者有梯度增加，可能会解决这一问题。
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图1 采自姑婆山的野生灰树花
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Fig.1 Wild Grifola frondosa in the Gupo Mountain
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3.2 灰树花菌丝体不同生长时期代谢通路
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基于数据库对主要差异代谢物进行注释并研究其相应通路，在10 d vs 20 d比较组中ABC转运蛋白途径和氨基酸的生物合成显著较高且富集的代谢物多，表明其具有较高的代表性。20 d vs 30 d比较组中代表性较高的是代谢途径，在10 d vs 30 d比较组中代表性较高的是氨基酸生物合成和亚油酸代谢。亚油酸代谢主要与菌丝体的生长发育、细胞分化、孢子萌发有关（Tsitsigiannis &Keller，2007；Niu et al.，2020）；ABC转运蛋白途径与灰树花菌丝体的关联机制尚不明确，根据崔亚忠等（2016）和陈道波等（2021）的研究，我们推测其可能与响应非生物胁迫、分生孢子萌发和菌丝生长以及抵抗有毒物质的能力有关，具体机制仍需进一步探究。
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图2 基于ITS序列采用邻接法（NJ）构建的培养菌株与灰树花及相关物种的系统发育树
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Fig.2 Phylogenetic tree of culture strains with Grifola frondosa and related species constructed by neighbor-joining (NJ) based on ITS sequence
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图3 灰树花菌丝体不同培养时期的PCA得分图
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Fig.3 PCA score plots of Grifola frondosa mycelium under different culture periods
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图4 正离子（A）和负离子（B）差异代谢物的聚类热图
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Fig.4 Clustering heat maps of differential metabolites of positive (A) and negative (B) ions
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图5 灰树花菌丝体不同培养时期的OPLS-DA置换检验图
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Fig.5 OPLS-DA replacement test of Grifola frondosa mycelium under different culture periods
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图6 不同培养时期灰树花菌丝体差异代谢物的部分鉴定图
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Fig.6 Partial identification of differential metabolites in Grifola frondosa mycelium under different culture periods
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实验中，培养前期酪氨酸、脯氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸大量表达，与雷露等（2020）统计发酵7 d的灰树花菌丝体代谢组学研究现象一致。氨基酸除了作为蛋白质成分，还参与菌丝体的生长和发育、抗氧化、代谢能量产生和生物胁迫。赵翰卿等（2020）研究表明，一定浓度的精氨酸和丙氨酸可以促进双孢蘑菇菌丝体的生长，浓度过高对菌丝体产生抑制。食用菌中氨基酸含量对其菌丝体生长发育、品质和风味等均具有重要影响，菌丝体中的谷氨酸和天冬氨酸可作为天然的鲜味剂且菌株游离氨基酸组分比达最适状态是确保菌株正常生长发育的重要生理基础（刘爱民等，2010；王舰等，2023）。
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图7 灰树花菌丝体培养10 d和20 d差异代谢物质荷比与P值散点图
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Fig.7 Scatter plots for mass-to-charge ratios and P values of differential metabolite Grifola frondosa mycelium cultured for 10 d and 20 d
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图8 灰树花菌丝体培养20 d和30 d差异代谢物质荷比与P值散点图
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Fig.8 Scatter plots for mass-to-charge ratios and P values of differential metabolite Grifola frondosa mycelium cultured for 20 d and 30 d
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图9 灰树花菌丝体培养10 d和30 d差异代谢物质荷比与P值散点图
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Fig.9 Scatter plots of differential metabolite charge ratios and P values of Grifola frondosa mycelium cultured for 10 d and 30 d
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图10 灰树花菌丝体代谢通路影响因子气泡图和柱状图
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Fig.10 Bubble diagrams and column diagrams of influencing factors of metabolic pathways in Grifola frondosa mycelium
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此外，我们发现3个比较组均显著富集到植物次生代谢产物的生物合成途径，推测灰树花菌丝体可能具有类似菌根真菌产生植物激素的能力（王有智和黄亦存，1997）。值得注意的是，灰树花虽然不像菌根真菌一样与植物根形成共生体，但和特定植物类群关系密切，其常与壳斗科植物相伴生，相关机制仍需进一步探讨。
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综上所述，我们认为不同培养时期的灰树花菌丝体代谢产物具有明显的差异，菌丝体中部分成分含量与培养时间有关，同时反映了不同代谢物在灰树花菌丝体中的表达趋势，解析了灰树花菌丝体不同培养时期的内在调控机制。这不仅丰富了我们对灰树花菌丝体不同生长期的代谢物质组成和差异的认知，还可通过选择灰树花菌丝体的最佳收获时间对其进行开发利用，也为根据代谢物种类和含量差异进行深入地开发灰树花提供了理论基础。
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摘要
为了解不同生长时期灰树花（Grifola frondosa）菌丝体的代谢产物差异及其通路，该研究采用HPLC-MS/MS分析方法对培养10、20、30 d的灰树花菌丝体进行分析。结果表明：（1）共42类584种代谢物被鉴定出，其中159种、47种和165种代谢物在对照组（10 d vs 20 d、20 d vs 30 d、10 d vs 30 d）中表现出不同的积累模式，不同培养时间的代谢物成分差异显著。（2）培养10 d产生较多与促进菌丝体生长和氧化供能有关的物质，培养20 d产生或积累了多种对人体有益的次生代谢物，如橄榄苦甙、甘胆酸、N-甲基酪胺、Alprazolam，培养30 d菌丝体中含有多种与产生香气有关的物质。（3）KEGG代谢通路富集分析，10 d vs 20 d比较组、20 d vs 30 d比较组和10 d vs 30 d比较组分别富集到163条、81条、137条代谢通路，氨基酸代谢在菌丝体不同培养时间中的影响最大。该研究初步探索了灰树花菌丝体的差异代谢物及代谢通路，并发现不同培养时间灰树花菌丝体代谢产物具有明显的差异，以及菌丝体中部分成分含量与培养时间有关，对灰树花菌丝体的质量控制和机理研究具有一定的参考价值。
Abstract
To gain a comprehensive understanding of the metabolite differences and metabolic pathways involved in the mycelium of Grifola frondosa during various culture periods, this study employed HPLC-MS/MS analysis to thoroughly investigate the mycelium cultured for 10, 20, 30 d. The results were as follows: (1) We identified a total of 584 metabolites belonging to 42 different categories. Notably, among these metabolites, 159, 47, and 165 metabolites exhibited distinct accumulation patterns in the control comparison groups of 10 d vs 20 d, 20 d vs 30 d, and 10 d vs 30 d, respectively. This significant variation in metabolite composition across different culture periods suggested that the metabolic activities of the mycelium were dynamically changing as it grew. (2) During the early stage of culturing (10 d), the mycelium produced a higher concentration of metabolites related to promoting its growth and oxidative energy supply. As the culture progressed to 20 d, the mycelium began to produce or accumulate various secondary metabolites that were beneficial to humans. These included compounds like oleuropein, glycyrrhetic acid, N-methyltyramine, and alprazolam, which were known for their biological activities and potential in health benefits. As the culture progressed to 30 d, the mycelium contained multiple compounds were associated with aroma production. (3) To further understand the underlying metabolic processes, we conducted KEGG metabolic pathway enrichment analysis. This analysis revealed that the comparison groups of 10 d vs 20 d, 20 d vs 30 d, and 10 d vs 30 d were enriched in 163, 81, and 137 metabolic pathways, respectively. Among these, amino acid metabolism emerged as the most significantly influenced pathway in different culture periods, and this finding underscored the importance of amino acid metabolism in driving the metabolic activities of the mycelium during its growth cycle. In conclusion, this study initially explores the differential metabolites and metabolic pathways of the mycelium of G. frondosa, and finds that there are significant differences in the metabolites of the mycelium of G. frondosa in different culture periods, and that the contents of some components in the mycelium is related to the culture time, which has a certain reference value for the quality control and mechanism research of the mycelium of G. frondosa.
关键词
灰树花菌丝体 ； 培养时间 ； 代谢产物 ； 代谢通路 ； HPLC-MS/MS
Keywords
mycelium of Grifola frondosa ； culture time ； metabolite ； metabolic pathway ； HPLC-MS/MS
