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红花檵木（Loropetalum chinense var. rubrum）又称红檵木、红桎木等，是金缕梅科（Hamamelidaceae）檵木属（Loropetalum）木本植物，湖南省著名的乡土彩叶植物，具有良好的观赏、生态环境保护及药用价值（郭佩瑶等，2022）。近年来，红花檵木异常叶色叶片现象逐渐受到国内学者关注，张艺帆等（2022）发现红花檵木季节性异常叶色叶片现象对植物本身并无伤害，只是在夏秋季节叶片出现较为明显的异常叶色叶片现象，而在冬春季节异常叶色叶片现象逐渐减少甚至消失。王燕和朱发仁（2007）认为红花檵木异常叶色叶片现象是由植物病毒而导致，但其并未明确该现象发生的具体原因。王慧（2023）对许璐等（2021）定义的小叶、红黄相间、黄绿相间、完全黄化、红斑5种典型红花檵木异常叶片类型的诱因研究发现，红花檵木异常叶色现象并非由细菌性病害、真菌性病害或缺素症而引起。但是目前，国内外对红花檵木的研究集中在栽培育种、生理特性、化学成分等方面，对红花檵木异常叶色叶片现象的研究仅关注在其表型、光合特性和病害等方面（许璐等，2021；张艺帆等，2022），尚无红花檵木内生细菌的多样性研究，也未有关于频发的异常叶色现象与叶片内生细菌及其群落的相关性探索。
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植物内生菌是寄存于植物体内不会对植物产生明显病害或暂时对植物没有伤害作用的微生物。在适宜的植物内环境中，内生菌的多样性丰富、优势度低、细菌种类分布均匀（Stone et al.，2000；江曙等，2008；顾美英等，2021；孟磊等，2023）。此外，内生菌与宿主植物之间存在的共生关系不仅能提高植物的抗逆能力、防治病害，还具有促生、固氮、生物修复等作用（Wani et al.，2015; Daniel et al.，2016; Bak &Gaj，2016）。相关研究发现，细菌侵入、细菌类群变化、细菌性病害等会导致植物局部或全株出现色泽异常现象，在柑橘、水稻植物中也发现了引起植株叶色变化的细菌微生物（谢志奎等，2021；陈苗苗和陈列忠，2022）。因此，初步推断红花檵木异常叶色变化现象或与内生细菌生存环境或菌群变化有关，红花檵木叶片可能是在其独特的生理响应下导致叶片内环境发生变化，进而引起叶片内生细菌多样性、优势度、种类分布等的改变，而细菌群落的改变又反作用于植物的生长发育而引起了其表型变化（Hou et al.，2020）。因此，明确红花檵木正常红色叶片和异常叶色叶片的微生物群落及多样性差异，有助于证明叶内细菌群落变化是因为叶色异常的“逆境”引起微生物变化的共同进化的结果，还是促使叶片异常叶色形成的诱因，并且从中还可筛选获得更多的优良菌种资源。
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因此，本研究以红花檵木异常叶色和正常红色叶片为研究对象，采用平板分离培养法和16S rDNA序列分析法分离鉴定内生细菌，通过多样性分析、群落结构分析和功能细菌测定筛选结果比较不同叶色叶片的差异性，深入探讨以下问题：（1）红花檵木叶片的内生细菌多样性及群落结构特征；（2）红花檵木各叶色类型叶片的内生细菌种类及结构差异性；（3）红花檵木异常叶色现象下的叶片功能菌群转变。以期获悉与红花檵木呈现异常叶色现象密切相关的微生物，为进一步明确红花檵木异常叶色的形成机制奠定基础；从叶片富集的内生细菌中发现功能菌，为后期的促生栽培提供宝贵菌种资源。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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1.1.1 植物材料
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于湖南农业大学花卉基地发生异常叶色现象较多的区域和其他未出现异常叶色现象的区域进行红花檵木‘大叶红’品种5种异常叶色叶片和正常红色叶片的采集，植物材料如图1所示。
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1.1.2 培养基
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内生细菌分离培养基：R2A、NA培养基（Reasoner &Geldreich，1985; 郝士海，1992）。溶磷功能筛选鉴定培养基：溶磷培养基（Solarbio）。固氮功能筛选鉴定培养基：Ashby无氮培养基（Solarbio）。产IAA（Indole-3-acetic acid）筛选鉴定培养基：King氏培养基（林国钦等，2022），其中Salkowski比色液配方为0.5 mol·L-1 FeCl3 1.5 mL、H2SO4 30 mL、蒸馏水50 mL。
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1.2 方法
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1.2.1 叶片内生菌分离
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分别称取1 g红花檵木正常红色和异常叶色叶片，自来水冲洗干净，75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl2消毒处理8 min，用无菌水冲洗5次，将最后1次冲洗过叶片的无菌水作为空白对照涂布于灭菌的培养基上，后期观察是否有细菌长出以确保分离获得的为内生细菌。将消毒后的6种类型叶片充分研磨进行不同浓度梯度（10-1~10-5）稀释后分别吸取100 μL均匀涂布于R2A和NA平板培养基上，每个处理重复3次，28℃恒温培养7 d后，记录稀释平板上菌落形态特征（大小、颜色、表面状态等），根据菌落形态选取能形成单菌落且菌落数最多的稀释梯度处理组计算生物量，挑取该稀释梯度培养的菌落纯化3次获得单菌落后转接至R2A、NA试管斜面培养基中培养并编号，形成大量菌落后于4℃保存用于后续细菌的分子鉴定确定其分类地位。编号格式为“培养基类型+叶片类型+组内菌种序号”。
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图1 红花檵木异常叶色叶片与正常红色叶片
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Fig.1 Abnormal colored and normally red-colored leaves of Loropetalum chinense var. rubrum
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1.2.2 内生细菌总DNA提取与鉴定
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采用煮沸法（Perez-Montano et al.，2014）提取菌株的基因组DNA，利用16S通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGT-TACCTTGTTAC GACTT-3′）扩增16S rDNA基因序列。PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）1 μL，dd H2O 18 μL，primer F（10 mmol·L-1）2 μL，primer R（10 mmol·L-1）2 μL，模板DNA 1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase1 μL。反应程序：预变性95℃ 3 min，变性95℃ 15 s，退火53℃ 15 s，延伸72℃ 1 min，彻底延伸72℃ 5 min，共计35个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将条带清晰的PCR扩增产物送至擎科生物科技有限公司测序，测得的细菌16S rDNA序列提交到EZBioCloud（https://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）比对确定其分类地位，并将测序结果上传至GenBank核酸序列数据库得到登录号。利用MEGA 6.0软件对其进行系统发育分析，采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，模型为K2P（kimura 2 parameter），Bootstrap置信值估算重复数设定为1 000次。
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1.2.3 多样性分析
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利用Shannon-Wiener（H）、Simpson（D）多样性指数及群落组成结构分析群落结构特征（许晴等，2011）。
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计算公式如下：
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式中： S为总物种数；Pi为第i个物种的比例；ln为Pi的自然对数。
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1.2.4 内生菌功能研究
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（1）供试菌株：红花檵木异常叶色和正常红色叶片中分离并挑选出的40株鉴定结果为不同种的内生细菌。
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（2）功能测定：溶磷功能测定方法参照赵龙飞等（2015）；固氮功能测定方法参照罗义等（2023）；产IAA功能测定方法参照Patten和Glick（2002）；耐盐功能测定是将菌株活化后接种至添加不同质量分数NaCl（0.5%、3.0%、6.0%、9.0%、12.0%、15.0%）的NA培养基上，于30℃培养8 d，3次重复，记录菌株生长情况。
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1.3 数据分析
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采用Microsoft Excel 2016、SPSS 21.0和GraphPad Prism 8软件进行数据统计分析和绘图。
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2 结果与分析
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2.1 红花檵木叶内生细菌的数量及分布特点
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内生细菌生物量如表1所示，6类红花檵木叶内生细菌在R2A分离培养基中分离到的生物量范围大于NA培养基，因此以R2A分离培养基培养获得的菌群生物量为参考依据计算细菌数量；红花檵木内生细菌在R2A分离培养基中的生物量范围为3.50×102~1.60×104 CFU·g-1。ZC叶片内生细菌生物量均低于其他的异常叶色叶片，其中HH的菌群生物量最大，达1.60×104 CFU·g-1。
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注：表中数据为平均数±标准差（n=3）。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。表中字母缩写详见图1图注。下同。
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Note: Data in the table are (n=3) . Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05) . The abbreviated letters see Fig.1 for details. The same below.
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2.2 红花檵木叶片内生细菌的分子生物学鉴定
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结合红花檵木异常叶色与正常红色叶片的内生细菌菌落形态特征初步归类后，采用16S rDNA序列分析法进行同源性比对分析，并构建系统发育树（图2）。由图2可知，共从红花檵木各类型叶片中分离获得906株细菌（表2），内生细菌数量依次为HH＞HL＞HB＞XY＞QH＞ZC。此外，经鉴定从正常红色、红黄和黄绿3种类型叶片中分离到的细菌鉴定归类均为6属6种；小叶类型叶片的内生细菌鉴定归类为13属15种；完全黄化类型叶片的内生细菌鉴定归类为4属5种；红斑类型的叶片内生细菌鉴定归类为7属12种。
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2.3 不同叶色类型叶片的内生细菌多样性及群落组成结构分析
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内生细菌多样性指数统计结果如表3所示，6类红花檵木叶内生细菌的Shannon-Wiener、Simpson指数范围分别为0.39~1.79和0.02~0.81。从代表群落丰富度的Shannon-Wiener指数来看，异常叶色叶片中XY的Shannon-Wiener指数显著高于其他类型叶片且与ZC叶片存在显著差异，表明其细菌丰富度最高。从代表群落集中程度的Simpson指数来看，ZC叶片数值最高，为0.81，表明其细菌群落集中；HH叶片的Simpson指数最低，为0.02，表明其细菌群落失衡。
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图2 基于16S rDNA序列构建的内生细菌系统发育树
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Fig.2 Phylogenetic trees of endophytic bacteria based on 16S rDNA sequences
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内生细菌群落结构如图3所示，红花檵木正常红色与异常叶色叶片内生细菌相对丰度在属、种水平下均有一定差异。红花檵木ZC、HH、HL、XY、QH、HB 6种类型叶片的优势属存在差别，HH叶片仅有1个优势菌属，甲基杆菌属（Methylobacterium，98.4%）；而ZC、HL、XY、QH、HB 5组的优势菌属有多个，各组中内生细菌相对丰度最高的属分别为马赛菌属（Massilia，27.3%）、沉积物杆状菌属（Sediminibacterium，49.1%）、甲基杆菌属（52.8%）、芽孢杆菌属（Bacillus，70.8%）、短小杆菌属（Curtobacterium，56.6%）；ZC叶片与5组典型异常叶色叶片比较发现，甲基杆菌属、假单胞菌属为红花檵木异常叶色叶片共有属。优势菌种数量各组也有差异，HH叶片仅有耐辐射甲基杆菌（Methylobacterium radiotolerans）1种优势菌，XY叶片有耐辐射甲基杆菌（M. radiotolerans）和栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）2种优势菌；ZC、HL、QH、HB叶片优势菌为3种及以上，各组相对丰度最高的种分别为马赛菌（Massilia neuiana，27.3%）、沉积物杆状菌（Sediminibacterium magnilacihabitans，40.1%）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，37.5%）、白色短小杆菌（Curtobacterium albidum，56.6%）；对比各类型叶片菌种组成发现，栖稻假单胞菌为红花檵木5种异常叶色叶片共有种且在正常红色叶片（ZC）中未分离到。
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结合细菌多样性指数和群落结构分布情况可知，Shannon-Wiener、Simpson指数较高的ZC叶片和XY叶片内生细菌多样性较丰富且群落结构分布较均匀，而Shannon-Wiener、Simpson指数最低的HH叶片内生细菌多样化程度较低且群落结构分布较为失衡。
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2.4 红花檵木内生细菌的功能分析
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2.4.1 溶磷能力测定
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40株红花檵木叶片内生细菌溶磷能力测定结果显示，有7株菌（表4）可在无机磷培养基上形成透明圈（图4），即具有溶磷能力，其中XY叶片中的栖稻假单胞菌NXY1-1溶磷能力最强，并且从异常叶色类型HH、XY叶片中分离的溶磷细菌的溶磷能力均高于ZC叶片中的菌株。
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2.4.2 产IAA能力测定
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红花檵木叶片内生细菌具产IAA能力的菌株如图5所示（IAA产量为0 mg·L-1的8株细菌未在图中标识），共有9株低产菌（IAA产量低于17 mg·L-1）、5株中产菌（IAA产量17~80 mg·L-1）、26株高产菌（IAA产量大于80 mg·L-1）。其中，XY、HH叶片细菌的产IAA能力范围均大于ZC叶片和其他3类异常叶色叶片细菌，高产菌种RXY2-6（Flavobacterium acidificum酸化黄杆菌）、RHH2-2（Pantoea anthophila喜花泛菌）、NXY1-1（Pseudomonas oryzihabitans栖稻假单胞菌）均分离自异常叶色叶片细菌。此外，高产菌也大多来自异常叶色叶片内生细菌的优势菌株，表明异常叶色叶片中富集了大量促进生长的产IAA功能菌。
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2.4.3 固氮能力测定
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细菌固氮能力测定见表5，结果显示，具固氮能力的细菌大都来自异常叶色叶片细菌的优势菌，占比达50%。其中，异常叶色叶片中XY、HB叶片具固氮能力的细菌较HH、HL、QH叶片多，占比分别为17.5%、10%，表明多样性丰富的异常叶色叶片细菌的固氮能力强于正常红色叶片。
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2.4.4 耐盐能力测定
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细菌耐盐能力测定结果如表5所示，40株内生细菌均可在含0.5%NaCl的低盐环境下生长，但随着盐浓度升高可生长的菌株数量减少。正常红色叶片内生细菌在高盐环境（9%~15% NaCl）下均不能生长，而异常叶色叶片内生细菌在高盐环境（≤15% NaCl）下均能生长。这表明异常叶色叶片内生细菌的耐盐能力强于正常红色叶片的内生细菌。
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图3 红花檵木叶片内生细菌群落结构
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Fig.3 Endophytic bacterial community structure in leaves of Loropetalum chinense var. rubrum
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图4 红花檵木叶片内生溶磷细菌能力测定结果
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Fig.4 Results of endophytic phosphorus solubilizing bacteria in leaves of Loropetalum chinense var. rubrum
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注：表中数据为平均值±标准差（n=4）。
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Note: Data in the table are (n=4) .
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3 讨论与结论
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本研究对红花檵木5种典型异常叶色叶片和正常红色叶片内生细菌进行分离鉴定，分析各类型叶色叶片内生细菌多样性、群落结构组成及功能菌的差异性，结果显示不同叶色类型的内生细菌的分离数量、在种和属分类水平上的优势菌群、细菌多样性、群落结构组成及功能菌群的分布存在较大差异。研究数据显示，红花檵木异常叶色叶片内生细菌数量均高于正常红色叶片，不仅红花檵木叶片有这种规律，茶树、柑橘的健康和发病叶片中内生细菌数量的研究结果也均为发病叶片中更高，其发病叶片也都发生了叶色变化（陈百文，2009；高爽，2017）。内生细菌数量与影响红花檵木叶片呈色的花青素含量表现为负相关（张艺帆等，2022）。茶树叶片也与之类似，其叶片中的花青素含量与微生物数量呈负相关（汪立群等，2016），而其他植物果实中也有发现花青素含量与微生物数量有负相关性，并指出花青素含量高的叶片会抑制微生物生长（Rogez et al.，2012）。由此可知，红花檵木异常叶色叶片中花青素含量较少，其微生物的生长繁殖未受到抑制，从而导致其内生细菌数量均较高。
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本研究获得的红花檵木正常红色叶片与异常叶色叶片内生细菌多样性数据显示，除小叶类型叶片以外，其他4类异常叶色叶片内生细菌多样性均低于正常红色叶片，而在山桐子和巨杉中也发现有类似结果，感病致使表型变化的叶片内生细菌多样性均低于健康叶片（岳雪华等，2020；周慧娜等， 2022）。与其他异常叶色叶片不同的是，小叶类型叶片不仅叶色有变化，叶片大小也明显缩小，综合前人研究结果可知红花檵木叶片和叶表的微生物会因光照、温度等外界因素的影响而发生叶色和内生微生物群落的变化（费芳等，2008；黄欣等，2017；杨宽等，2021）。因此，推断小叶类型叶片急剧缩小导致其光合作用面积减少，而植物为保障有足够的光合能力来满足植物的正常生长发育需求，增强植物与内生细菌的协同作用，通过丰富内生细菌的多样性和增加特定菌群数量的方式，借助微生物来提高植物适应环境的能力。
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图5 红花檵木叶片内生细菌的产IAA能力水平分析
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Fig.5 Analysis on IAA production ability of endophytic bacteria in leaves of Loropetalum chinense var. rubrum
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红花檵木异常叶色叶片内生细菌在种、属分类水平上的相对丰度值较正常红色叶片高，内生细菌的群落结构也较正常红色叶片菌群失衡，并且在叶片中富集了甲基杆菌属和假单胞杆菌属细菌，其中栖稻假单胞菌的相对丰度值明显增高。在紫荆泽兰（Zhou et al.，2010）和茶树（陈义勇等，2023）的相关研究中也发现，病叶内生细菌的群落结构和相对丰度值与健康叶片相比都有显著差异。红花檵木异常叶色叶片中分离到的假单胞菌属、甲基杆菌属的细菌也可以引起其他植物叶片变色并出现病斑，在水稻中还发现栖稻假单胞菌可使谷粒出现浅褐色斑点或整个谷粒呈深棕色的现象（冯洁，2017；Hou et al.，2020），红花檵木的叶色变化可能也与这两类微生物有关。分析不同红花檵木叶片中获得的功能菌情况发现，异常叶色叶片中有大量功能菌富集，其溶磷、耐盐、固氮和产IAA的能力高于正常红色叶片中分离的功能菌且有4株兼具以上4种功能。异常叶色叶片中富集的具溶磷和耐盐能力较高的菌属分别是假单胞菌属和芽孢杆菌属，这2个属细菌曾在小麦和柠条中分离获得并被证实具有较强的溶磷和耐盐能力（Zumft，1998；代金霞等，2012；鞠向阳，2014；Kushwaha et al.，2020）。从红花檵木叶片中分离获得了26株高产IAA细菌，其产IAA能力均高于小麦、黄连等植物的内生细菌IAA分泌水平（Malik et al.，1997；向益青等，2023），最高产的3株细菌也均分离自异常叶色叶片中。由此可知，红花檵木叶片发生颜色变化的原因可能是红花檵木异常叶色叶片中富集有大量的微生物，叶片受某些特定微生物菌群的影响，其内生细菌数量、多样性、相对丰度及功能菌群的数量增加，使叶片形成了独特的菌群特征，但菌群的变化并未让红花檵木叶片内生细菌转化为致病菌使植物出现病害或死亡现象，只是使其叶片出现了表型变化，富集的功能菌反而还具有协助植物生长发育的作用。
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注： +表示有该功能特征；-表示无该功能特征。
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Note: + indicates the function is enabled; -indicates the function is not enabled.
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综上所述，红花檵木叶片内生细菌较丰富，尤其是异常叶色叶片中富集了大量内生细菌和功能细菌，其叶片内生细菌数量、多样性、群落结构、功能菌群都发生了变化，并且富集的优势菌群有可能使叶片叶色发生改变，这种富集特定菌群的行为极有可能与其异常叶色现象有关。本研究分离获得的大量内生细菌及功能菌资源可为今后进一步明确红花檵木叶异常色形成机制提供参考依据，并对红花檵木优质高效栽培有重要应用价值。
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摘要
为探讨红花檵木叶片内生细菌与其季节性异常叶色现象的相关性，该文采用平板分离培养法和16S rDNA序列特征分析法从红花檵木5类异常叶色和正常红色叶片中分离鉴定内生细菌，分析不同叶色叶片的细菌多样性、群落结构和功能菌水平差异。结果表明：（1）5类异常叶色叶片内生细菌生物量较高，分离的906株细菌经鉴定为26属40种。（2）小叶类型叶片内生细菌种类最多且群落结构均匀，而红黄类型的结果与其相反。（3）异常叶色叶片与正常红色叶片的菌群比较发现，不但其优势属、种差异明显，而且在异常叶色叶片中富集大量甲基杆菌属和假单胞杆菌属细菌，尤其是栖稻假单胞菌明显增多。（4）异常叶色叶片（小叶、红斑和红黄类型）中富集了具有溶磷、固氮、产IAA、耐盐功能的细菌，其中有4株兼具以上4种功能，由此推断这种富集功能菌的行为极有可能与异常叶色现象有关。该文揭示了红花檵木异常叶色现象与特定内生细菌菌群富集密切相关，为红花檵木异常叶色的形成机理研究提供了线索，对红花檵木优质高效栽培具有重要应用价值。
Abstract
In this study, in order to to investigate the correlation between endophytic bacteria in the leaves of Loropetalum chinense var. rubrum and the seasonal abnormal leaf coloration phenomenon of this plant, we performed plate isolation and culturing and subsequent 16S rDNA sequence analysis to isolate and identify endophytic bacteria from five types of abnormally colored leaves and normally red-colored leaves of L. chinense var. rubrum; we also analyzed differences in bacterial diversity, community structure, and functional levels among differently colored leaves. The results were as follows: (1) Compared with the normally red-colored leaves, we detected higher biomass of endophytic bacteria in the five types of abnormally colored leaves. Among the isolated bacteria, 16S rDNA sequence alignment and phylo-genetic tree analysis revealed that the presence of 906 bacterial strains were classified into 26 genera and 40 species. (2) While the smaller leaves were colonized by the largest number of endophytic bacterial species with a relatively uniform community structure, the opposite was true for bacteria isolated from the red- and yellow-pigmented leaves. (3) Comparison of the bacterial community data for abnormally colored leaves and those with the normally red-color revealed that not only were there significant differences with respect to the dominant genera and species, but also an enrichment of numerous bacterial species in the genera Methylobacterium and Pseudomonas in the five types of abnormally colored leaves. Particularly, we detected significantly larger numbers of Pseudomonas oryzihabitans. (4) We established that abnormally colored leaves (smaller, red spotted, and the red and yellow types) were characterized by an enrichment of bacteria with phosphorus solubilization, nitrogen fixation, IAA production, and salt tolerance functions, among which, four strains were found to have all four of these functions. Accordingly, we speculate that the abnormal leaf coloration of L. chinense var. rubrum is closely associated with the activities of these enriched functional bacteria. Our findings in this study indicate that the abnormal leaf coloration of L. chinense var. rubrum is closely associated with the enrichment of specific endophytic bacterial communities, which can thus provide clues for elucidating the mechanisms underlying the development of abnormal leaf color in this plant. Moreover, this may have important application value for the efficient cultivation of high-quality L. chinense var. rubrum.
