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重金属污染是世界上最受关注的环境问题之一，对环境和人类有着各种影响。铬是对人体具有致癌和致突变作用的典型重金属之一（Mishra &Bharagava，2016）。为适应对废水排放要求越发苛刻的限制形势，许多技术被用来脱除废水中的铬，如微滤技术、吸附法、化学沉淀法、萃取法和电解法（Fu &Wang，2011）。其中，吸附法性价比最高，而传统吸附法存在着明显缺点，如化学药剂用量大、成本高、需要后期进行脱水处理、金属去除不彻底或者易产生二次污染等（Joseph et al.，2019）。近年来，微生物吸附法因具有成本低廉、易于处理、可获得性广泛、资源丰富和与金属结合能力强等优点而受到了人们的重视（Vendruscolo et al.，2017; Wei et al.，2018）。应用的微生物包括微藻（Daneshvar et al.，2019; Pradhan et al.，2019）、真菌（de Rossi et al.，2018; Shi et al.，2019）和细菌（Ma et al.，2018）。铬的形态主要表现为三价铬（Cr3+）和六价铬[Cr（Ⅵ）]。与Cr（Ⅵ）相比，尽管Cr3+毒性较弱，但Cr3+所造成的伤害同样不可忽视，若吸入的氧化铬浓度为0.012~0.033 mg·m-3时，可诱发鼻出血、鼻黏膜萎缩和鼻中隔穿孔，甚至严重时会引起肺癌（钟雅洁等，2007； 霍小平和刘存海，2009）。目前，在铬污染微生物修复领域，大多数研究集中在Cr（Ⅵ）的吸附或还原，对Cr3+的去除研究不多。李欣等（2011）从皮革铬鞣、复鞣污泥等处分离纯化出丝孢酵母TP、蜡样芽孢杆菌XB、蜡样芽孢杆菌MY和土曲霉TQ等菌株，其吸附Cr3+的最大吸附量分别为26.8、19.3、16.9、21.4 mg·g-1；海洋解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus sp. JZ008）对Cr3+的吸附量约为0.4 mg·g-1湿菌体（林梵宇等，2018）；短乳杆菌（Lactobacillus brevis）对水溶液中Cr3+的最大吸附量约为32 mg·g-1（代启虎等，2019）；米曲霉AS3.951干菌体对 Cr3+的吸附量为6.66 mg·g-1（吴俊贤，2017）。现有报道的Cr3+微生物吸附剂存在种类较少、吸附量较低、吸附速率慢等问题。因此，亟需寻找新的高效吸附Cr3+的微生物，以补充和完善微生物法修复铬污染的菌源。
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重金属超积累植物（hyperaccumulator）（陈一萍，2008）是一类能超量吸收重金属且使其富集的特殊植物，如东南景天（杨肖娥等，2002； 何冰等，2014）、堇叶碎米荠（郭松明等，2022）、 Nopalea cochenillifera（Adki et al.，2013）、野薄荷（高洁等，2012）等，在重金属污染修复中的应用日益广泛。近年来，为了弥补植物修复易受生长周期、地理环境等影响的不足，植物内生菌的应用开始得到研究者的重视。植物内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，并且不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物（Wilson，1995）。植物内生菌在与宿主植物长期共存或互存过程中逐渐形成了自身的独特之处，在宿主植物的生长和抵抗环境胁迫中起着重要作用（Rho et al.，2018）。从超富集植物中分离获得可吸附相应重金属的内生菌已有报道，如As超富集植物蜈蚣草（董睿智，2012）、Zn超富集植物东南景天（龙新宪等，2013）、Cd超积累植物龙葵（曹喆等，2009）、Mn超积累植物商陆（卢文显，2015）等。李氏禾（Leersia hexandra）是张学洪等（2006）在中国桂林境内首次发现的铬超积累植物，在铬污染的环境中生长非常迅速且繁殖能力强（张学洪等，2008），其对Cr3+和Cr（Ⅵ）都有较强的富集能力（陈俊等，2008； 卢媛媛等，2013）。本课题组前期从李氏禾叶和根中分别分离筛选出内生芽孢杆菌Bacillus sp. Y04和阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae G04，并将其应用于Cr（Ⅵ）的还原（袁治豪，2018；韩文等，2019）。
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蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01是本课题组首次从李氏禾茎部组织中分离获得的1株内生细菌，前期对该菌株去除Cr（Ⅵ）的性能进行了研究（李海云等，2022），研究过程中发现其对Cr（Ⅵ）的去除机理可能与三价铬的吸附有关。针对现有的Cr3+微生物吸附剂种类偏少、吸附效率不高等问题，本研究以李氏禾内生蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体为吸附材料，考察其对Cr3+的吸附性能。采用单因素实验方法考察温度、pH、Cr3+初始浓度、吸附剂用量、吸附时间等因素对Cr3+平衡吸附量和吸附率的影响，建立较优的吸附工艺条件，并探讨其等温吸附过程、动力学过程、热力学过程及吸附机理，以期为该菌株在生物除铬领域的应用奠定基础，也为Cr3+的微生物吸附提供一种新的途径，同时为李氏禾铬积累机制中微生物作用研究提供参考。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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1.1.1 主要试剂
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盐酸、硫酸（衡阳市凯信化工试剂有限公司）；氯化铬、尿素、氨水、丙酮、氢氧化钠、氯化钠（西陇化工股份有限公司）；高锰酸钾（汕头市光华化学厂）；亚硝酸钠、琼脂粉（成都市新都区木兰镇工业开发区）；氯化铬（天津市光复精细化工研究所）；磷酸（长沙市分路口塑料化工厂）；胰蛋白胨、酵母浸粉（北京陆桥技术有限责任公司）; 无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；二苯碳酰二肼[百赛勤化学技术（上海）有限公司]。
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1.1.2 菌株
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蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01：分离自铬超富集植物李氏禾茎部的内生细菌菌株，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 14267。
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1.1.3 培养基
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LB固体培养基：胰蛋白胨10.0 g·L-1，氯化钠10.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，琼脂15.0 g·L-1，蒸馏水1 000 mL。pH调整至7，121℃下灭菌20 min。
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LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g·L-1，氯化钠10.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，蒸馏水1 000 mL。pH调整至7，121℃下灭菌20 min。
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1.1.4 主要仪器设备
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ZXRD-B5110型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；冰箱（博西华家用电器有限公司）；SW-CJ-IF型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；PB-10型pH计、SQP型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LRH-250-Z型振荡培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；BXHW型电热套（巩义市英峪予华仪器厂）；UV760CRT型紫外分光光度计（上海傲谱分析仪器有限公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DL-5-B型离心机（上海安亭科学仪器厂）。
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1.2 实验方法
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1.2.1 Bacillus cereus J01菌体吸附剂的制备
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斜面保存的Bacillus cereus J01接种至LB固体培养基平板活化，于37℃恒温培养箱中培养24 h后，挑取2环菌体接种在含100 mL液体培养基的250 mL三角瓶内，在37℃恒温水平摇床中以120 r·min-1的转速振荡培养24 h（为107~108 CFU·mL-1）。共培养20批次，每批次10瓶。培养完毕后，121℃高温下灭菌20 min，10 000 r·min-1下离心10 min去除上清液，收集且合并菌体，冷冻干燥后即得蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附剂，密封贮存于4℃冰箱中备用。
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1.2.2 吸附实验
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在100 mL具塞锥形瓶中加入一定浓度Cr3+溶液50 mL，加入一定量的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体，用0.1 mol·L-1盐酸或氢氧化钠调节至所需pH 值，控制一定温度，以120 r·min-1振荡吸附一定时间后，取适量反应液于10 000 r·min-1下离心10 min，收集上清液，采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB/T7467—87）测定残余的Cr3+浓度。按公式（1）和公式（2）分别计算吸附量和去除率。每个处理均设置3次平行实验，结果以平均值表示。
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1.2.3 吸附热力学公式
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式中： R为气体常数（8.314 J·mol-1·K-1）；T为温度（K）；KD为热力学分散系数；平衡常数qe为平衡吸附量（mg·g-1）；Ce为平衡吸附浓度（mg·L-1）；△H表示吸附体系的焓变； △G表示吸附体系的吉布斯自由能变； △S表示吸附过程熵变代数之和。
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1.2.4 红外光谱分析
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分别收集在0、50、100、200 mg·L-1 Cr3+溶液中吸附12 h的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体，干燥至恒重，与KBr按比例磨细混匀，压薄，用FTIR光谱仪测定，并记录其光谱。
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2 结果与分析
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2.1 反应条件对Cr3+吸附的影响
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2.1.1 pH值对吸附的影响
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pH值能直接影响吸附剂的表面活性官能团交换作用的能力，而吸附重金属离子的关键机制之一就是离子交换过程。pH值对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+的影响如图1所示，当pH值在3~6范围时，吸附剂对Cr3+的平衡吸附量和去除率都呈现上升趋势；而当pH值在6~8之间时，菌体对Cr3+的平衡吸附量和去除率都呈现下降趋势。在pH值为6时，吸附剂对Cr3+的平衡吸附量和去除率都达到最大值，分别为33.76 mg·g-1和90.70%。因此，6为较佳的吸附pH值。
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2.1.2 温度对吸附的影响
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温度是影响吸附效率的重要因素之一，随着温度的逐渐升高，分子间的布朗运动随之加快，溶质与吸附剂表面接触的机会也会增加。温度对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+的影响如图2所示，当吸附温度在25~40℃范围时，平衡吸附量和去除率都随着温度的升高而增加，温度的升高有利于反应向吸热方向移动；当超过40℃时，平衡吸附量和去除率反而急剧下降，若温度过高耗能就变大，高温会使Cr3+与吸附剂脱离，从而不利于吸附。因此，40℃为较佳的吸附温度。
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图1 pH值对吸附的影响
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Fig.1 Influence of pH value on adsorption
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图2 温度对吸附的影响
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Fig.2 Influence of temperature on adsorption
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2.1.3 初始Cr3+浓度对吸附的影响
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初始Cr3+浓度对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+的影响如图3所示，随着初始Cr3+浓度的增加，平衡吸附量也逐渐增大，在达到一定浓度后，吸附量的上涨趋于平缓。重金属吸附过程与重金属浓度和吸附剂投放量有关，在25~150 mg·L-1范围内，平衡吸附量随着Cr3+浓度的增大而快速增大，去除率随着Cr3+浓度的增大而缓慢减小，表面位点几乎被占满；在150~300 mg·L-1范围内，平衡吸附量的上涨趋于平稳，而去除率随着Cr3+浓度的增加而快速减小。因此，150 mg·L-1为较佳的初始Cr3+浓度。
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图3 初始Cr3+浓度对吸附的影响
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Fig.3 Influence of initial Cr3+ concentration on adsorption
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2.1.4 吸附剂投加量对吸附的影响
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蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体投加量对吸附Cr3+的影响如图4所示，在投加量达到0.2 g之前，随着投加量增加，Cr3+的去除率也随之增加，最高去除率为90.36%。这可能是由于失活菌体与Cr3+接触的表面积增大，因此给Cr3+提供了更多的吸附位点。但是，当失活菌体的剂量继续增加时，吸附剂相互碰撞的机会增加，颗粒相互吸引，有效的吸附基团被覆盖，吸附的表面积反而随之减小，从而导致去除率下降。因此，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体较佳的投加量为0.2 g。
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2.1.5 时间对吸附的影响
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时间对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+的影响如图5所示，在0~12 h之间，平衡吸附量和去除率随着吸附时间的增加而增大，此时的平衡吸附量最高（34.29 mg·g-1），去除率达到91.52%。这可能是由于此时失活菌体表面空白的吸附位点较多，故Cr3+可以与失活菌体表面的吸附位点迅速结合；12 h后，随着时间的增长，吸附位点逐渐饱和，达到吸附平衡，平衡吸附量和去除率几乎不再变化。因此，12 h为较佳的吸附时间。
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图4 吸附剂用量对吸附的影响
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Fig.4 Influence of adsorbent dosage on adsorption
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图5 时间对吸附的影响
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Fig.5 Influence of time on adsorption
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2.2 等温吸附模型
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吸附等温线是指在某一温度下，吸附量随着平衡浓度的改变而改变的曲线。最常见的吸附等温线主要有2种表现形式，分别是朗格缪尔模型和弗伦德利希模型。Cr3+的吸附等温线拟合情况如图6所示，所得到的相关数据见表1。由表1可知，朗格缪尔方程的线性拟合系数（R2）为0.996 1，而弗伦德利希方程的线性拟合系数（R2）只有0.893 3。这表明朗格缪尔吸附等温线模型可以更好地模拟蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+吸附的热力学过程，吸附过程更倾向于单分子层的吸附。
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图6 吸附等温线
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Fig.6 Adsorption isotherm
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2.3 吸附过程动力学分析
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吸附过程动力学的研究通常是指描述吸附剂吸附速度的快慢，它通过动力学模型对数据进行拟合，进而探讨其吸附的机理。本研究中，动力学实验数据使用准一级动力学和准二级动力学拟合。从表2可以看出，R2值相差较小，而准二级反应动力学模型中菌体预测的Qe值与实验值q更相符。因此，准二级动力学方程更适合用来描述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体的吸附过程。
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2.4 吸附过程热力学分析
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吸附热力学的研究可以了解吸附过程发生的驱动力和程度。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+过程的热力学参数值如表3所示。△H＞0表示此吸附过程是吸热反应。△S表示吸附过程熵变代数之和，熵变一般是用于解释系统的混乱程度变化之和。熵变很小的情况，说明相对有序；熵变很大的情况，说明系统的混乱程度变化很大。当温度升高，分子热运动增加，从而增加了吸附Cr3+的概率。当温度达到303 K时，△G＜0反应可自发进行。
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2.5 红外光谱分析
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采用傅立叶红外光谱方法研究李氏禾内生细菌蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体组分中不同化学官能团在吸附Cr3+后的变化，结果如图7所示。在3 500~3 200 cm-1范围的吸收峰，主要是O—H/N—H的振动伸缩吸收峰，来自蛋白质、脂肪酸及多糖等组分。肽键中C
O的伸展运动、—NH的振动和—CN伸展振动分别出现在1 650 cm-1吸收峰的附近。1 400 cm-1与1 240 cm-1表示的是羧基和羧酸的CO的振动。上述这些官能团是在生物吸附剂吸附重金属过程中发挥重要作用的基本组分。随着Cr3+浓度的增加，3 455.18 cm-1处的—NH峰和—OH峰的强度逐渐减小，表明菌体表面的—NH、—OH在Cr3+的吸附中具有重要作用；在1 636.52 cm-1处也有较强的吸收峰，肽键中CO峰和—NH峰有较明显的变化。当金属离子附着在有机化合物的官能团上时，会吸引官能团上的电子云，从而导致电子密度降低和键长增加。与不加Cr3+的体系相比，加入不同浓度Cr3+后，在400~800 cm-1波段内出现了金属氧键的伸缩振动峰，说明菌体表面结合了铬。红外光谱分析结果表明，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+起吸附作用的主要官能团是—NH、—OH、CO。 -
3 讨论与结论
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微生物在重金属吸附领域中的应用非常广泛，特别是微生物失活菌体作为吸附剂，具有无需营养维护、可长期储存等特点，被广泛用于重金属离子的吸附（Ozdemir et al.，2003；Xu et al.，2017）。李氏禾作为一种铬超积累植物，目前对其内生菌的研究报道不多。本研究以李氏禾内生蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体为吸附材料，考察其吸附Cr3+的性能和机制。本研究吸附性能结果表明，在最适条件下，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+的平衡吸附量和去除率分别可达34.30 mg·g-1、91.60%，并且在12 h时可达吸附平衡，吸附效率高于已有的报道（李欣等，2011；林梵宇等，2018；代启虎等，2019）。究其原因，可能是由于李氏禾的铬超积累性能一方面为内生菌提供了一个高铬浓度的生长环境，从而提高了内生菌的铬抗性；另一方面，内生菌作为李氏禾植物体的一部分，在抵抗铬胁迫过程中能够通过吸收或吸附等作用将铬进行固定，以降低其对李氏禾的胁迫强度。类似的结果在其他超积累植物内生菌研究中也得到了验证（曹喆等，2009；董睿智，2012；龙新宪等，2013；卢文显，2015）。
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图7 不同Cr3+浓度下的红外光谱分析
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Fig.7 FTIR spectra of hexandra endophytic fungi
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本研究中，等温吸附结果表明，朗格缪尔吸附等温模型优于弗伦德利希模型，说明吸附过程倾向于单分子层吸附；吸附动力学结果表明，准二级反应动力学模型计算的平衡吸附量（32.26 mg·g-1）与实验吸附结果（34.30 mg·g-1）更接近，说明质量扩散步骤对吸附速率的影响可以忽略，限速步骤是化学吸附过程。该过程可能与金属离子和生物细胞之间电子共享或电子交换的共价力有关，推测蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附过程很可能是以细胞表面附着为主；而吸附体系的焓变△H＞0，表明吸附过程是吸热反应，升高温度有利于吸附的进行，当温度达到303 K时吸附体系的吉布斯自由能变△G＜0，反应可自发进行。上述结果表明，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附以化学吸附为主，这与已报道（李群等，2014；麻淳雅等，2020；林海等，2021）的微生物吸附重金属过程相似。本研究中，红外光谱分析结果表明，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体吸附Cr3+主要通过菌体表面蛋白质、脂肪酸及多糖中的—NH、—OH、C
O等官能团起作用，这进一步验证了菌体对Cr3+的吸附过程是以表面络合为主的化学吸附过程。 -
综上所述，李氏禾内生细菌蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+具有较高的吸附效率，在环境铬污染的治理中具有较好的应用潜力，今后尚需深入研究培养条件对该菌株吸附Cr3+性能的影响以及扩大其培养工艺，为该菌株的实际应用奠定基础。本研究结果为Cr3+的微生物吸附提供了一种新的途径，也为李氏禾铬积累机制中微生物作用的研究提供了一定参考。
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摘要
为考察李氏禾内生细菌蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01菌株吸附Cr3+的性能，以蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体作为生物吸附剂，采用单因素实验方法考察pH、温度、Cr3+初始浓度、吸附剂用量、吸附时间等条件对Cr3+吸附性能的影响，分析其等温吸附过程、动力学过程及热力学过程，并采用红外光谱方法对吸附机理进行初步分析。结果表明：（1）在50 mL反应体系中，当pH值为6、温度为40 ℃、Cr3+初始浓度为150 mg·L-1、吸附剂投加量为0.2 g、吸附时间为12 h时，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附性能达到最佳，其平衡吸附量和Cr3+去除率分别为34.30 mg·g-1、91.60%。（2）等温吸附过程分析结果显示，朗格缪尔吸附等温模型能更好地模拟蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附，其吸附过程更倾向于单分子层吸附。（3）吸附过程动力学分析结果显示，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附更符合准二级动力学速率方程。（4）吸附过程热力学分析结果显示，在40 ℃下，吸附过程的△G、△H和△S分别为-2.609 kJ·mol-1、61.792 kJ·mol-1和206.11 J·mol-1，该温度下吸附过程是自发过程。（5）红外光谱分析结果显示，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus J01失活菌体对Cr3+的吸附可能通过细胞成分中的氨基、羟基和羰基起作用。该研究结果表明该菌的失活菌体对Cr3+具有较强的吸附性能，并在铬污染的环境治理中具有较好的应用潜力。
Abstract
The effects of pH, temperature, initial Cr3+ concentration, adsorbent dosage, time, and other factors on the adsorption capacity of Cr3+ were examined by the single factor test method using inactivated Bacillus cereus J01 strain as biological adsorbent in order to investigate the adsorption performance of Cr3+ by endophytic bacterium Bacillus cereus J01 from Leersia hexandra Swartz. The kinetic, thermodynamic, and isothermal adsorption processes were analyzed. Infrared spectroscopy was used to provide a preliminary analysis of the Cr3+ adsorption mechanism. The results were as follows: (1) In the reaction system of 50 mL, inactivated Bacillus cereus J01 reached the best adsorption performance on Cr3+ when pH value was 6, temperature was 40 ℃, initial concentration of Cr3+ was 150 mg·L-1, adsorbent dosage was 0.2 g and adsorption time was 12 h. The equilibrium adsorption capacity was 34.30 mg·g-1 and the removal rate of Cr3+ was 91.60%. (2) The Langmuir isothermal adsorption model could better simulate the adsorption of Cr3+ by inactivated Bacillus cereus J01. The adsorption process was more similar to monolayer adsorption. (3) The adsorption kinetics analysis showed that the adsorption of inactivated Bacillus cereus J01 on Cr3+ was more consistent with quasi-second-order kinetic rate equation. (4) Thermodynamic analysis of adsorption showed that at 40 ℃, △G, △H and △S were -2.609 kJ·mol-1, 61.792 kJ·mol-1 and 206.11 J·mol-1, respectively. The adsorption process was spontaneous at 40 ℃. (5) The results of infrared spectroscopy showed that the adsorption of inactivated Bacillus cereus J01 on Cr3+ could be attributed to the effects of amino, hydroxyl and carbonyl groups in the cell components. The results show that the inactivated bacteria of this bacterium has strong adsorption capacity for Cr3+, and has good application potential in the treatment of environmental chromium pollution.
Keywords
Bacillus cereus ； adsorption ； Cr3+ ； Leersia hexandra ； endophytic bacterium
