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烟草是我国重要的经济作物，在山地现代农业发展实践中具有重大作用。近年来，由丁香假单胞菌烟草致病变种（Pseudomonas syringae pv. tabaci）引起的野火病（tobacco wildfire）已演变成烟草种植的主要细菌性叶斑类病害，常与角斑病、赤星病、棒孢霉叶斑病等混合发生，造成烟叶生产的严重经济损失（张广民等，2002；陈焘等，2018）。
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植物病害发生在很大程度上与植物微生态环境失衡密不可分，叶际微生物是叶际微生态环境中的重要组成成分。研究表明，叶际微生物群落结构的稳定程度与植物叶片健康具有较强的相关性（Lindow &Brandl，2003; Shakir et al.，2021）。随着高通量测序技术的发展与成熟，越来越多的学者应用该技术研究植物病害与微生物群落间的关系（Li et al.，2022）。烟草作为以收获叶片为主的重要经济作物，其真菌性叶部病害发生与叶际微生物群落间的关系研究已有诸多报道。例如，黄宇等（2020）对烟草白粉病研究表明，健康烟叶（健叶）叶际真菌群落丰富度及多样性高于病叶，病叶和健叶的叶际优势真菌均为高氏白粉菌属（Golovinomyces）、曲霉属（Aspergillus）和链格孢属（Alternaria）且病斑组织的丰度高于健康组织；烟草赤星病叶际微生物群落以子囊菌门和变形菌门为主，链格孢属和假单胞菌属分别为真菌和细菌的优势属，但健叶真菌和细菌群落多样性及丰富度高于病叶（刘亭亭等，2021；Dai et al.，2022）；Sun等（2023）报道了感染靶斑病的烟株叶片病原菌的丰度随病级增加而显著上升，叶际真菌群落多样性和丰富度均低于健叶，细菌群落多样性高于健叶而丰富度低于健叶。由此可见，由真菌引起的烟草叶部病害其叶际微生物群落的变化与发病程度存在密切关联。
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烟草野火病是一种细菌性病害，20世纪40年代末期在我国云南烟区零星发生。随着烟草栽培面积逐渐扩大，野火病常与其他烟草叶部病害混合发生，病害流行年份造成重大损失。目前，针对烟草野火病发生的影响因素研究主要集中于气候、温湿度等环境因子，而对于叶际微生物的群落结构及多样性尚缺乏深入的认知。程浅（2020）探讨了烟草叶际细菌群落结构与野火病发生的关系，但缺少真菌群落结构的相关研究。Si等（2023）研究了野火病对雪茄烟的影响，表征感染叶片与健叶之间的微生物群和化学因子差异，但未对不同病害程度的野火病烟叶做出进一步分析。烟草野火病不但在田间为害烟叶，而且在烟叶采收后至烘干前仍可继续为害，导致叶片病斑继续扩大变成枯焦状而失去烘烤价值。因此，亟须阐明其病害流行程度与叶际微生物群落的动态变化。鉴于此，本研究以不同发病程度的烟草野火病烟叶为研究对象，采用高通量测序技术，拟探讨以下问题：（1）不同程度发病烟叶病斑组织与健康组织中微生物群落结构与多样性差异；（2）不同发病程度病斑组织微生物群落的变化；（3）不同发病程度烟叶组织微生物的功能变化。旨在为认识烟草野火病的演变规律提供科学依据。
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1 材料与方法
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1.1 样品采集
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2019年6月，在种植品种为云烟87的贵州省施秉县烟叶产区（107°51′36″—108°28′51″ E、26°49′47″—27°21′15″ N）采集移栽60 d后发生烟草野火病的烟叶样品，根据病斑面积占比分为轻度（5%~10%）、中度（11%~20%）和重度（21%~50%）叶片（图1），依次记为A、B、C。用无菌剪刀剪取样品叶片的病斑组织（b）和健康组织（j），分别混合均匀置于50 mL无菌离心管中，每个样品3管，每管5 g。样品采集后放入低温保存箱，并迅速带回实验室，置于-80℃冰箱保存、备用。
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1.2 基因组DNA提取、PCR扩增及高通量测序
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参照Fast DNA® SPIN试剂盒（MP Biomedicals）使用说明，提取叶际微生物基因组总DNA，经超微量分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）检测质量与浓度后，用无菌水将DNA稀释至1 ng·μL-1备用。
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细菌16S rRNA基因和真菌转录间隔区ITS1区分别采用引物515F/806R（Yuan et al.，2020）和ITS5-1737F/ITS2-2043R（Wu et al.，2019）进行扩增。PCR扩增体系及程序参照Apprill等（2005）。扩增产物经2%浓度琼脂糖凝胶电泳检测、GeneJET胶回收产物纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）纯化后送至北京诺禾致源科技股份有限公司，利用Ion Plus Fragment Library试剂盒（Thermo Fisher Scientific）构建文库并在Ion S5TMXL平台上进行测序。
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1.3 数据质控及群落结构与多样性分析
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下机数据经Cutadapt（https://cutadapt.readthedocs.io/en/v1.9.1/）软件剔除、过滤低质量序列，以及UCHIME算法去除嵌合体序列，最终得到有效序列（clean reads）。使用UPARSE（http://www.drive5.com/usearch/）软件在相似度≥97%的条件下对clean reads进行OTU（operational taxonomic units）聚类，筛选每个OTU的代表性序列，并基于Mothur算法将OTU代表性序列与Unite（7.2）数据库和Silva132数据库比对、注释物种分类（Edgar &Robert，2013; Urmas et al.，2013）。利用R语言工具绘制物种群落柱状图、主成分分析（principal component analysis，PCA）图和Venn分析图等。利用QIIME（https://docs.qiime2.org）按样本最小序列数进行样本序列抽平后，计算样品微生物群落α多样性指数（Shannon、Simpson、Chao1等）；使用DPS软件（http://www.dpsw.cn/download.html）进行不同组别物种相对丰度的差异性分析。采用Tax4Fun程序语言及FUNGuild和KEGG数据库分析真菌、细菌群落的功能类群（孙美丽等，2023）。
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2 结果与分析
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2.1 测序深度评估及数据质控
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稀释性曲线结果显示，叶际细菌的OTU数在测序数据量为2 300时曲线趋于平坦（图2：A），叶际真菌的OTU数在测序数据量为40 000时曲线趋于平坦（图2：B），表明测序数据已包含所测样品中绝大多数的物种信息，测序结果合理。
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原始测序数据质控后，平均每组样品的细菌和真菌分别获得80 092条和70 147条高质量序列（表1）。细菌与真菌原始测序数据的GenBank Accession Number分别为PRJNA1025832、PRJNA1025370。
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2.2 叶际细菌与真菌群落结构
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2.2.1 门水平叶际群落结构
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健康与病斑组织的细菌群落包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其中病斑组织变形菌门的相对丰度高于健康组织（图3：A）。轻度、中度和重度病叶病斑组织的优势细菌门为变形菌门（相对丰度分别为49.44%、72.39%和61.92%），其次为厚壁菌门（相对丰度分别为0.01%、1.54%和0.73%）和拟杆菌门（相对丰度分别为0.06%、0.19%和0.06%）。健康组织优势细菌为变形菌门（Aj、Bj和Cj的相对丰度分别为2.89%、8.76%和3.15%）。轻度病叶的病斑与健康组织的变形菌门相对丰度无显著性差异，而中度和重度病叶病斑组织的变形菌门相对丰度显著高于健康组织；厚壁菌门和拟杆菌门在6组样品间无显著性差异（表2）。
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图1 野火病烟叶症状
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Fig.1 Symptoms of tobacco leaves with wildfire disease
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图2 物种稀释性曲线
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Fig.2 Species rarefaction curves
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健康和病斑组织的真菌群落主要为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）（图3：B）。其相对丰度病斑组织高于健康组织，其中重度病叶病斑组织与健康组织间子囊菌门相对丰度存在显著性差异。在轻度、中度和重度病叶病斑组织中，子囊菌门的相对丰度分别为10.25%、25.86%和32.22%，担子菌门的相对丰度分别为4.52%、2.48%和4.35%。健康组织子囊菌门相对丰度随病害程度的增加而减少（Aj、Bj和Cj的相对丰度分别为6.31%、5.14%和0.47%），而担子菌门相对丰度随病害程度的增加而增加（分别为0.19%、0.30%和0.47%）。
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2.2.2 属水平叶际群落结构
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由图4：A可知，健康与病斑组织的细菌群落在属水平上为假单胞菌属（Pseudomonas）和泛菌属（Pantoea）。病斑组织Ab、Bb和Cb假单胞菌属的相对丰度（分别为39.47%、59.83%和46.05%）与健康组织Aj、Bj和Cj假单胞菌属的相对丰度（分别为0.57%、5.95%和1.10%）存在显著差异。病斑组织泛菌属的相对丰度随病害程度增加而逐级上升，与健康组织无显著性差异。
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烟叶健康和病斑组织的真菌群落优势属包括链格孢属（Alternaria）、小不整球壳属（Plectosphaerella）和锥盖伞属（Conocybe），其病斑组织的相对丰度高于健康组织，但无显著性差异（图4：B），而茎点霉属（Phoma）在健康组织的相对丰度高于病斑组织，并且在轻度病叶中二者存在显著性差异。
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2.2.3 OTU属水平叶际群落结构
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由图5可知，病斑与健康组织样品共有的细菌和真菌OTU数目分别为9和190，其中共有的细菌OTU分别属于假单胞菌属、泛菌属、立克次氏体目Rickettsiales等，共有的真菌OTU分别属于链格孢属、锥盖伞属、小不整球壳属、茎点霉属等。病叶Bb和健叶Bj样品细菌群落独有的OTU数目较其他烟叶样品高（图5：A）；病叶Bb样品真菌群落独有的OTU数目较其他烟叶组织高（图5：B）。
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2.3 叶际微生物群落α多样性
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由表3可知，烟叶健康与病斑组织的覆盖度指数均大于0.997，表明测序结果包含绝大多数微生物群落。供试6组样品细菌群落的Simpson指数、ACE指数和覆盖度指数均无显著性差异，仅轻度病斑组织的Shannon指数与健康组织存在显著性差异，中度病斑组织的Chao1指数显著高于轻度和重度病叶健康组织。病斑组织细菌群落物种多样性与丰富度高于健康组织，Shannon指数和Simpson指数随烟叶病害程度的增加呈先减后增的变化趋势，而Chao1指数和ACE指数则呈现先增后减的趋势；健康组织的细菌群落多样性和丰富度指数随病害程度的增加呈先增后减的趋势。
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图3 门水平群落组成
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Fig.3 Communities composition of phylum level
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轻度和中度病斑组织真菌群落多样性和丰富度均高于健康组织，但重度病斑组织真菌群落多样性和丰富度低于其健康组织。Bb样品的Shannon指数与Simpson指数显著高于Cb、Aj、Bj样品；6组样品组织真菌群落的Chao1指数、ACE指数和覆盖度指数均不存在显著性差异。病斑组织的真菌群落多样性和丰富度指数随病害程度的增加呈先增后减的趋势；健康组织的Shannon指数和Simpson指数随病害程度的增加而增加，Chao1指数和ACE指数则随发病程度的增加而降低。
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2.4 叶际真菌与细菌群落功能预测
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基于KEGG数据库对叶际细菌群落PICRUSt功能预测结果表明，在第一级功能层水平上，健康和病斑组织叶际细菌的主要功能为新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞转化、人类疾病以及有机系统6类生物代谢通路（图6：A）。健康和病斑组织的叶际细菌基因功能大体相同且相对丰度无显著性差异。
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基于FUNGuild功能预测，健康与病斑组织叶际真菌生态功能类群相似。健康和病斑组织叶际真菌优势类群包括植物病原菌、动物病原菌-内生真菌-植物病原菌-木质腐生真菌、未定义腐生真菌、木质腐生真菌和植物病原菌-木质腐生真菌。病斑组织的植物病原菌类群相对丰度高于健康组织，中度病叶病斑组织Bb相对丰度最高（6.23%），其次为Ab（5.27%）、Cb（2.50%），而健康组织中Bj组相对丰度最高（0.91%）。动物病原菌-内生真菌-植物病原菌-木质腐生真菌类群的相对丰度在病斑组织Bb（6.51%）远高于其他病斑和健康组织。病斑组织的未定义腐生真菌、木质腐生真菌类群相对丰度均高于健康组织，前者在病斑组织Cb中（4.66%）相对丰度最高，后者在Bb组（1.04%）相对丰度最高；健康组织的植物病原菌-木质腐生真菌类群相对丰度高于病斑组织，健康组织Aj中（1.84%）相对丰度最高（图6：B）。
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3 讨论与结论
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丰富多样的叶际微生物与宿主植物的健康生长密切相关。叶际微生物能够帮助宿主植物固氮、促进其生长、增强其抗逆和抗病能力，但其存在的病原微生物也可通过侵染叶片组织并在叶际定殖积累导致植物发病（Abdelfattah et al.，2015；杨宽等，2021）。本研究基于高通量测序技术，从微观层面解析了感染野火病烟叶健康与病斑组织叶际微生物的异同，并揭示了不同发病程度叶片叶际微生物群落结构与多样性。
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本研究发现，感野火病烟叶的健康与病斑组织叶际微生物菌群结构在物种相对丰度上存在较大差异。病斑和健康组织的叶际细菌优势门和属分别为变形菌门和假单胞菌属及泛菌属等，皆为烟草叶际常见菌群，与Qin等（2019）对烟草野火病田间防治、孙美丽等（2023）对靶斑病烟叶叶际优势细菌和刘畅等（2020）对赤星病烟叶叶际优势细菌等研究报道一致。烟草野火病作为细菌性病害，常与真菌性病害协同发生，烟田中野火病与靶斑病、赤星病等复合侵染造成烟株发病的案例屡见不鲜，因此其优势细菌类群或存在相似之处。假单胞菌属作为野火病的病原，其相对丰度在病斑组织显著高于健康组织，表明病原菌的大量定殖是导致野火病蔓延发生的主要原因。虽然泛菌属在病斑和健康组织中的相对丰度无显著性差异，但其丰度随病害程度的增加而逐级上升，说明泛菌属与烟草野火病的发生存在正相关关系，可能在病害发生时具有潜在促进作用。叶际真菌主要分布于链格孢属、小不整球壳属和锥盖伞属等，这与刘亭亭等（2022）、向立刚等（2020）研究结果类似。链格孢属真菌的存在，表明烟叶后期存在赤星病与野火病混合发生的可能，这从目前烟田病害发生规律上可见一斑。此外，链格孢属、小不整球壳属和锥盖伞属在病斑组织的富集丰度明显高于健康组织，表明三者在病害发生时可能与病原菌存在协同促进的作用，有助于病害发生。值得注意的是，茎点霉属在健康组织的相对丰度高于病斑组织，并且在轻度病叶中二者存在显著性差异，表明其在病害抑制中具有潜在作用。针对叶际微生物中变化显著的优势菌群值得进一步功能探索与研究。
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注：同行不同小写字母表示显著性差异（P＜0.05）。
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Note: Different lowercase letters in the same row indicate significant differences (P＜0.05) .
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图4 属水平群落组成热图
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Fig.4 Heatmap of the community composition at genus level
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图5 不同样本共性及特性OTU分析
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Fig.5 OTU analysis on commonality and characteristics of different samples
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注：真菌和细菌样品同列不同字母表示差异性显著（P＜0.05）。
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Note: Different letters in the same column for fungal and bacterial samples indicate significant differences (P＜ 0.05) .
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图6 功能预测
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Fig.6 Functional prediction
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微生物之间高度复杂的关系使得局部某些病原菌或有益菌的相对丰度变化直至引起整个群落组成的改变，而植物病害发生伴随着病原菌的入侵定殖，常常会改变微生物环境和群落结构，对微生物群落多样性产生影响（刘宇星等，2022）。Zhang等（2018）发现南瓜白粉病病原菌Podosphaere的丰度随病情加重而增加；Sun等（2023）对不同病害等级烟草靶斑病烟叶的研究表明，叶际病原菌的相对丰度随着烟叶病级的增加而显著上升；陈乾丽等（2019）对不同霉变程度烟叶霉烂病的研究结果发现，病原菌Aspergillus在霉变重的烟叶叶片中的相对丰度较霉变轻的烟叶更高。综上表明，病原菌丰度及群落特征常与烟叶发病程度存在一定相关性。本研究对选取的3类不同发病程度的野火病烟叶进行微生物群落结构分析发现，在轻度、中度和重度病叶病斑组织中假单胞菌属的相对丰度均大于39%，但在中度病叶病斑组织中其相对丰度最高，这与前人研究结果和预测有所不同。此外，烟叶健康与病斑组织的微生物多样性指数随着病害程度的增加呈先增后减或逐级递减。造成这种现象可能的原因是在野火病发病初期，叶片组织完整性被破坏，引起环境中包括病原菌在内的各类微生物涌入遭破坏的组织中大量定植，进而造成病斑组织微生物群落多样性和丰富度短暂增加，但随着病斑面积扩大，叶片有限的营养物质和生存空间不断降低，微生物间的定殖和竞争加剧，最终导致病原菌以及其他微生物数量降低。Huang等（2021）对不同病级的亚隔孢壳属叶斑病烟叶的研究也有类似发现，发病烟叶组织虽然在功能预测中显示植物病原菌相对丰度随病害增加而成比例上升，但叶际病原菌Didymella的相对丰度在病害后期反而有下降趋势。这恰与本研究假单胞菌属的相对丰度在重度病斑组织中表现出降低趋势一致。叶际微生物群的结构变化因受到环境等因素的影响往往难以准确预测，但其趋势大体可循。一般而言，病原菌和与其相关联的微生物菌群大量定植于叶片组织造成的叶际微生态平衡被破坏是导致烟叶病害发生的微观机制之一。由此可知，烟草病害的防治可围绕抑制破坏病原菌和相关菌群的定植进而达到生物防控的目的。刘天波等（2021）利用拮抗菌防治烟草野火病得到较好效果，并发现假单胞菌属、泛菌属等烟草叶际微生物所占比例发生显著变化，芽孢杆菌属作为有益菌相比对照增加3.9倍。
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叶际微生物在定植积累过程中常发挥自身特定的生理功能，与其群落结构及组成密切相关（高爽等，2016）。本研究中功能预测发现，健康和病斑组织的细菌类群基因功能信息及相对丰度较为趋同，以代谢、遗传信息处理和环境信息处理3种功能为主，该结果与烟草角斑病、靶斑病的叶际细菌功能预测结果较为一致（吴小军等，2023；孙美丽等，2023），其原因可能是野火病菌在以上叶际病害中也常被作为优势类群，因而功能预测存在相似之处。本研究发现，病斑组织细菌多样性与丰富度高于健康组织，推测野火病侵染烟叶后，假单胞菌属、泛菌属等菌群在叶际养分的利用上占据主要地位，在定植过程中获取营养物质而大量繁殖，进一步刺激和开发其代谢、遗传和环境信息处理等功能，进而演变为感病烟叶叶际优势细菌属。此外，本研究还发现在病斑与健康组织叶际真菌群落功能预测中，病原菌、内生真菌及腐生真菌等占据主导地位，病斑组织的植物病原菌类群相对丰度高于健康组织，这与Huang等（2021）报道一致，进一步说明了植物病原菌和内生真菌、腐生真菌为烟草叶际优势真菌类群，植物病原菌是导致叶际病害的重要原因。
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摘要
叶际微生物种群稳定与烟株健康密切相关。为揭示感染野火病烟株叶际微生态特征，该文采用Illumina高通量测序技术对不同发病程度烟株叶片的病斑和健康组织进行微生物群落结构与多样性分析。结果表明：（1）病斑组织与健康组织优势菌为变形菌门（Proteobacteria）和子囊菌门（Ascomycota），并且其在病斑组织的相对丰度显著高于健康组织；优势属为假单胞菌属（Pseudomonas）、泛菌属（Pantoea）、链格孢属（Alternaria）、小不整球壳属（Plectosphaerella）和锥盖伞属（Conocybe），仅假单胞菌属在病斑组织的相对丰度显著高于健康组织。（2）病斑组织细菌群落多样性和丰富度高于健康组织，并且随病害程度的增加，多样性指数和丰富度指数分别呈先减后增和先增后减的趋势；病斑组织真菌群落丰富度和多样性指数随病害程度的增加先增后减，轻度和中度病叶病斑组织真菌群落多样性指数和丰富度高于健康组织，但重度病叶病斑组织真菌群落多样性指数和丰富度低于健康组织。（3）病斑和健康组织细菌的基因功能信息及相对丰度基本类似，主要为代谢、遗传信息处理和环境信息处理3类；真菌的优势功能类群为植物病原菌、动物病原菌-内生真菌-植物病原菌-木质腐生真菌、未定义腐生真菌、木质腐生真菌和植物病原菌-木质腐生真菌。该研究结果为认识烟草野火病演变规律及叶际微生物群落特征提供了科学依据。
Abstract
The stability of phyllosphere microbial community is closely related to plant health. In order to understand the microecological characteristics of tobacco leaves infected with wildfire disease, community structure and diversity of phyllosphere microbiome in diseased spots and healthy tissues of tobacco leaves with different degrees of disease were analyzed using high-throughput sequencing technology in this paper. The results were as follows: (1) The dominant microorganisms in diseased and healthy tissues were Proteobacteria and Ascomycota, and their relative abundance in diseased tissues was significantly higher than that in healthy tissues. The dominant genera were Pseudomonas, Pantoea, Alternaria, Plectosphaerella and Conocybe, and only the relative abundance of Pseudomonas in diseased tissues was significantly higher than that in healthy tissues. (2) The diversity and richness of bacterial communities in diseased spots were higher than those in healthy tissues, and the diversity index showed a trend of decreasing and then increasing with the increase of the disease degree, and the richness index showed a trend of increasing and then decreasing. The richness and diversity index of fungal communities in diseased spots showed a trend of increasing and then decreasing with the increase of the disease degree, and the diversity index and richness of fungal communities in diseased spot tissues of mildly and moderately diseased leaves were higher than those in healthy tissues, but the diversity index and richness of fungal communities in heavily diseased tissues were lower than those in healthy tissues. (3) Gene functional information and relative abundance of bacteria in diseased spots and healthy tissues were generally similar, primarily were metabolism, genetic information processing and environmental information processing. The dominant functional taxa of fungus were plant pathogen, animal pathogen-endophyte-plant pathogen-wood saprotroph, undefined saprotroph, wood saprotroph and plant pathogen-wood saprotroph. The results provide a reference for the understanding of evolutionary pattern of tobacco wildfire disease and characterization of the phyllosphere microbial community.
