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多星韭（Allium wallichii）是一种多年生草本植物，属百合科（Liliaceae）葱属（Allium L.）粗根组（Sect. Bromatorrhiza），主要分布于我国云南、贵州、四川西南部、西藏东南部、广西北部和湖南南部等西南地区（中国科学院中国植物志委员会，1980）。“贵州屋脊”毕节市赫章县韭菜坪是世界最大面积的天然野韭菜花带，多星韭为该植物保护区的绝对优势物种（丁卫红等，2007; 唐汉青等，2020）。葱属植物含有丰富的营养物质和多种生物活性成分，具有广泛的生理和药理功能（刘建涛等，2007; 司民真等，2014）。韭菜是我国重要的葱属蔬菜，在人们日常膳食中起重要作用（郭凤领等，2013）。韭菜叶和薹中含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、纤维素、维生素C和多种微量元素，用途广泛，具有保健和食疗的功效（蹇黎和朱利泉，2009）。韭菜籽中含有生物碱、核苷、甾体皂苷、黄酮、挥发油、不饱和脂肪酸等活性成分，具有抗血小板聚集、抗肿瘤和抗真菌的功能（邹忠梅等，1999; 张新茹等，2009; 李欢等，2017）。多星韭叶和薹中氨基酸、微量元素、维生素C等营养物质的含量均高于普通韭菜（王海平等，2017）。野韭菜是韭菜品质遗传改良的宝贵资源，赫章县多星韭种质资源丰富，多星韭籽产量高，但由于自然发芽率低等因素，因此野生种质未得到很好的利用（朱宽香等，2017）。近年来，对多星韭的研究大多在染色体核型鉴定、营养成分分析和生物活性物质提取与应用等方面。然而，基于代谢组学对韭菜籽代谢物和代谢物途径研究还鲜有报道（邹晓菊，2013; 孙婕等，2014; 刘盼盼等，2015）。
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代谢组学分析是一种基于高通量化学检测整个生物体内小分子代谢物数据的研究方法，从生物体中检测和筛选差异显著的代谢物，并在此基础上研究相应的代谢过程和变化机制（Nicholson et al.，1999）。目前，已广泛应用于生物学、医学、药学、农学、食品等科学领域（Sumner et al.，2015）。常被用于植物应激反应机制研究、疾病诊断和药物鉴定、植物不同部位代谢差异、食物营养成分和品质鉴定等（Fatma et al.，2007; Brennan et al.，2013; Rao et al.，2017; Casas-FERREIRA et al.，2019）。李乐乐（2020）利用HILIC-LC-MS技术对人参和西洋参化学成分进行鉴定，在人参皂苷、寡糖和氨基酸三种成分中找到了区分人参和西洋参的标志物。黄晓荣（2017）采用LC-MS技术对黑花生和栽培花生种子进行代谢组学研究，发现黑花生与其栽培品种的营养成分存在差异，并找到黑花生的优势营养成分。姚诗琪等（2020）通过GC-MS的代谢组学方法发现掌叶草中的三萜皂苷能有效抑制肝癌肿瘤生长。代谢组学为分析不同植物品种间代谢产物的差异，特别是为药用植物的有效成分及代谢通路研究提供了方法。
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本研究基于超高效液相色谱和串联质谱（UPLC-MS/MS）的代谢组学方法，检测多星韭籽和韭菜籽2种材料的代谢组分，筛选其中差异显著的生物活性物质并分析相关的代谢途径，以期为韭菜的遗传改良提供指导，为多星韭籽食用、药用等功能产品的开发提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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本研究材料为2020年9月在全国唯一的野生韭菜花保护区，即在贵州省毕节市赫章县韭菜坪（103°36′—104°45′ E、26°19′—27°27.28′ N）采集的多星韭籽。该地区处于我国西南喀斯特连片分布区，海拔约2 700 m，气候温暖，太阳辐射量高，气温日差较大、年差较小。多星韭籽为秋季果实成熟后采收果序晒干搓出种子除去杂质得到，形状近似三角盾形，种皮坚硬且腹背有细细的皱纹，千粒重为3.754 g（图1:A）。韭菜籽为平顶山农科院选育的‘平韭6号’，形状呈扁卵形或半卵形，表面粗糙且有细密网状皱纹，千粒重为4.776 g（图1:B）。
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图1 多星韭籽（A）与韭菜籽（B）形态
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Fig.1 Morphology of Allium wallichii seeds (A) and A. tuberosum seeds (B)
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1.2 方法
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1.2.1 试验方法
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多星韭籽与韭菜籽2种样品各设3个生物学重复，将6个样品放置于冻干机中，在真空条件下冷冻干燥后使用研磨仪使其成粉末状。称取100 mg韭籽粉末溶于甲醇提取液中，在涡旋锅中涡旋6次后置于4℃冰箱过夜。次日经离心后吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后保存滤液于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。用超高效液相色谱和串联质谱数据采集系统进行代谢物分离鉴定。
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1.2.2 色谱条件
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色谱柱选择Agilent SB-C18（10 cm × 2.1 mm）; 流动相A相为加入0.1%甲酸的超纯水，B相为加入0.1%甲酸的乙腈; 洗脱梯度0.00 min时B相比例设为5%，9.00 min内上升至95%，并在95%保持1 min，10.00~11.10 min时B相减少至5%，并保持5%平衡至14 min; 柱温为40℃; 进样量为4 μL; 流速为0.35 mL·min-1。
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1.2.3 质谱条件
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LIT和三重四极杆（QQQ）扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪（QTRAP），UPLC-MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件控制正负2种离子模式运行。ESI源操作参数如下:离子源，涡轮喷雾; 源温度550℃; 离子喷雾电压（IS）5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）; 离子源气体I（GS I），气体Ⅱ（GS Ⅱ）和帘气（CUR）分别为50、60、25.0 psi，碰撞诱导电离参数为高。在QQQ和LIT模式下，分别用10、100 μmol·L-1聚丙二醇溶液进行仪器调谐与质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。通过进一步的DP和CE优化，完成各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测1组特定的MRM离子对。
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1.2.4 质控样本
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质控（quality control，QC）样本通过等量混合多星韭籽和韭菜籽制备而成质控样本（mix），与分析样本采用相同的色谱和质谱检测分析方法，共设置3个生物学重复。同时，为监测分析过程中的样本重复性，在每10个分析样本中随机插入1个质控样本，共插入3个，共计9个样本。
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1.3 数据处理
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利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，基于武汉迈特维尔生物科技公司自建数据库MVDB及代谢信息公共数据库，根据二级谱信息进行代谢物定性，以MultiaQuant软件进行质谱峰的积分校正。利用R语言中的内置统计prcomp函数对数据进行归一化（unit variance scaling，UV）处理，并对2组样品进行主成分（PCA）分析，PCA用R语言软件（base package）（版本3.5.0）（www.r-project.org）的内置统计prcomp函数，设置prcomp函数参数scale=True，表示对数据进行UV归一化。利用R语言中的内置cor函数计算皮尔逊相关系数r来检测重复样品相关性。利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）将原始数据进行log2转换后进行中心化处理，公式为; 使用R语言中的Metabo AnalystR包（版本1.0.1）OPLSR.Anal函数进行数据分析得到变量重要性投影值（VIP），为避免过拟合，对其进行200次排列测试以验证模型准确性。用UV将差异代谢物含量数据归一化处理后通过R语言中的pheatmap包（版本1.0.12）绘制热图，用聚类分析（HCA）分析不同样品间代谢物积累规律。将得到的差异代谢物映射到KEGG PATHWAY数据库中（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html），进行相关通路分析，并通过超几何检验的P值确定其显著性。
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2 结果与分析
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2.1 样本质控分析
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PCA是一种能在最大限度保存原始数据信息的前提下，通过建立数学模型把高维复杂数据进行简化降维来总结样本代谢谱特征的统计方法。由图2:A可知，各组间存在明显的分离趋势，说明每个样本的数据处理结果是可信的，每个样本之间存在明显差异。由图2:B可知，通过样本间的皮尔逊相关系数r观察到多星韭籽（Kunth）、韭菜籽（Rottl）和质控样本（mix）组内的r均大于0.9，说明组内的重复样本相关性极强、重复性好，可以用于后续差异代谢物分析。
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OPLS-DA可以去除主成分分析中无关的差异信息，从而筛选出差异代谢物。由图3:A可知，多星韭籽和韭菜籽在PC1主成分上有明显的分离，所建的OPLS-DA模型对X和Y矩阵的解释率分别为R2X = 0.907、R2Y = 1，对模型预测的Q2值是0.999，这3个指标的值都接近1，表示模型稳定可靠有效，能较好地预测结果。为了避免过拟合，我们使用OPLS-DA模型进行200次随机排列组合实验进行验证，当Q2的P = 0.02时，说明4种随机分组模型的预测能力都优于OPLS-DA模型，当R2Y的P = 0.545时，说明对Y矩阵的解释率有109个随机分组模型优于OPLS-DA模型。一般情况下，P ＜ 0.05时模型最佳。由图3:B可知，Q2和R2Y的P值均小于0.005，表明模型可用且可根据VIP对差异代谢物进行筛选。
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2.2 代谢物分析
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根据MRM代谢物检测多峰图，分别从多星韭籽和韭菜籽中检测到733个和634个代谢物，结果见图4。利用MultiaQuant软件进行色谱峰积分和校正，确保定性、定量分析的准确性。以KEGG PATHWAY数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）为背景，检测到的782个代谢物中有457个通过MB Role网站的ID转换功能获得了KEGG输出ID。
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代谢物的聚类分析可用于简单直观地观察代谢物组成。从图5可以看出，2种韭籽代谢产物的相对含量存在明显差异。在检测到的782种代谢产物中，有黄酮、脂类、酚酸、氨基酸及其衍生物、有机酸、核苷酸及其衍生物、生物碱、甾体、萜类、木脂素类和香豆素类、鞣质等。
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2.3 差异代谢物筛选
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基于OPLS-DA结果，多变量分析模型的VIP可以筛选出多星韭籽与韭菜籽之间差异的代谢物。由图6:A可知，靠近右上角和左下角的代谢物有显著差异，红色表示VIP≥1的代谢物质。利用差异倍数值（fold change，FC）可结合单变量统计分析来进一步筛选差异代谢物，以2组样品中差异为2倍以上或0.5以下认为是差异显著，即FC≥2或FC≤0.5。2组差异代谢物的数量和变化可以从图6:B的火山图中清楚看到，从多星韭籽和韭菜籽中检测到的782种代谢物中筛选出12类492种差异代谢物，其中多星韭籽中114种代谢物与韭菜籽相比上调，378种下调。为了便于观察代谢物变化规律，对差异代谢物归一化处理并绘制热图，结果如图5所示。差异代谢物种类由多到少分别是107种黄酮、71种脂类、57种酚酸、52种氨基酸及其衍生物、41种有机酸、30种核苷酸及其衍生物、31种生物碱、39种其他类、34种甾体、16种萜类、 11种木脂素和香豆素类、3种鞣质。对差异代谢物的log2（FC）值进行排序，列出差异倍数最高（上调和下调）的代谢物，结果如表1所示。多星韭籽与韭菜籽相比上调幅度前20的差异代谢物有6种黄酮、5种甾体皂苷、3种黄酮醇、2种酚酸类、2种异黄酮、1种游离脂肪酸、1种三萜皂苷，其中上调差异倍数最大的代谢物是三萜皂苷类的延龄草苷-6-O-槐三糖苷（trillium-6-O-sophorotrioside）在多星韭籽中约为韭菜籽中的1.0×106倍。下调幅度前20的差异代谢物中有12种甾体皂苷、4种黄酮醇、1种黄酮、1种生物碱、1种吲哚类生物碱、1种氨基酸及其衍生物，其中下调差异倍数最大的代谢物是甾体皂苷中的tuberoside R，属于新呋甾烷型皂苷，在韭菜籽中约为多星韭籽中的7.8×105倍。从表1可以看出，在多星韭籽中上调幅度大的差异代谢物种类较多，主要是黄酮和甾体皂苷，而下调幅度大的差异代谢物主要是甾体皂苷。
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图2 多星韭籽与韭菜籽的PCA得分（A）和相关性（B）
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Fig.2 PCA scores (A) and correlation (B) of Allium wallichii seeds and A. tuberosum seeds
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图3 多星韭籽与韭菜籽的OPLS-DA得分图（A）和验证图（B）
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Fig.3 OPLS-DA scores (A) and verification (B) of Allium wallichii seeds and A. tuberosum seeds
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图4 MRM代谢物检测多峰图
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Fig.4 Multimodal graph of MRM metabolite detection
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图5 样本全部代谢物质分类聚类热图
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Fig.5 Classification and clustering heat map of all metabolites in all samples
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图6 多星韭籽与韭菜籽的正交偏最小二乘法的S-Plot图（A）和差异代谢物火山图（B）
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Fig.6 S-Plot (A) of OPLS-DA and volcano plot (B) of screening differential metabolites of Allium wallichii seeds and A. tuberosum seeds
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图7 多星韭籽与韭菜籽的差异代谢物KEGG富集图
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Fig.7 KEGG enrichment map of differential metabolites of Allium wallichii seeds and A. tuberosum seeds
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2.4 代谢通路
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差异代谢物的通路富集分析有助于了解代谢途径的变化机制，使用KEGG PATHWAY数据库注释检测到的差异代谢物并进行通路富集分析。在多星韭籽与韭菜籽492种差异代谢物中，共注释到84条代谢通路，其中差异代谢物富集较多且显著的通路有2-氧代羧酸代谢、苯丙烷生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、类黄酮生物合成、托烷和哌啶及吡啶生物碱的生物合成、赖氨酸代谢等（图7）。图7结果表明，每种代谢途径有多种代谢物参与，部分代谢物也可参与多个代谢途径。以P≤0.01为阈值，共筛选到4条富集极显著的通路（表2）。因此，通过查阅相关文献，本研究构建了甾体皂苷的生物合成途径。甾体皂苷是由甾体皂苷元和糖基缩合而成的糖基皂苷。甾体皂苷有许多糖基，包括阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、呋喃糖等，在2组差异代谢物中，检测到多星韭籽中丙酮酸、薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元、阿拉伯糖苷等显著上调表达，其log2（FC）值分别是韭菜籽的4.58、17.18、17.24、11.93倍。同时发现，2组样品间多种葡萄糖苷、鼠李糖苷、半乳糖苷以及木糖含量存在差异，推测其可能为形成甾体皂苷的底物或中间物质。
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3 讨论与结论
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3.1 多星韭籽与韭菜籽差异代谢物
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代谢产物是生物表型的基础，可以直观有效地理解生物学过程及其机制（熊欢欢等，2019）。本研究采用UPLC-MS/MS的广泛靶向代谢组学技术分析Kunth和Rottl的代谢组分，结果表明Kunth和Rottl组内重复样本的相关系数均在0.90~0.99，表明重复性极好，PCA结果表明代谢物具有明显差异。2种韭籽中共检测到782种代谢物，其中差异代谢物检测出492种，多星韭籽中包括114种上调代谢物和378种下调代谢物。上调代谢物中有34种黄酮、22种甾体、12种核苷酸及其衍生物、11种酚酸、9种有机酸、9种其他类、6种氨基酸及其衍生物、6种生物碱、4种糖及醇类、4种维生素、2种萜类、2种脂质、1种木脂素和香豆素类以及与1种新木质素; 下调代谢物中有73种黄酮、69种脂质、46种氨基酸及其衍生物、46种酚酸、32种有机酸、25种生物碱、20种糖及醇类物质、18种核苷酸及其衍生物、14种萜类、12种甾体、10种木脂素和香豆素类、8种维生素、3种鞣质以及苯乙烯、对羟基桂皮酸酰对羟基苯乙胺等。从本研究看出，不是所有的差异代谢物质在多星韭籽中都比韭菜籽高，不应过分青睐野生植物品种，而应根据研究目的与不同需求选择性加以利用。
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3.2 多星韭籽与韭菜籽差异代谢通路
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本研究基于KEGG PATHWAY数据库对差异代谢物进行注释，共获得了84条代谢通路，其中，4条通路的差异代谢物多且较为显著，分别是黄酮和黄酮醇的生物合成、托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成。其中，苯丙烷代谢途径是植物次生代谢产物合成的主要途径之一，可为下游次生代谢产物的合成提供原料。植物的许多次生代谢产物，如色素、酚酸、黄酮、类黄酮、木质素等都是由这一代谢途径及其分支途径产生（欧阳光察和薛应龙，1988; 文欢等，2017）。苯丙氨酸被苯丙氨酸脱氨酶（PAL）催化产生肉桂酸，由肉桂酸羟化酶（C4H）产生对羟基香豆酸，经4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）催化生成4-香豆酸CoA。进入下游特异性合成途径，转化为不同的苯丙素类代谢产物，包括香豆素、黄酮类、萜类、木质素、花青素等（王玉等，2019）。因此，苯丙烷类代谢通路与多星韭籽和韭菜籽中黄酮、类黄酮、萜类和酚酸类物质的差异密切相关。
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葱属是百合科植物中最为重要的家族之一，而甾体皂苷是葱属植物中最重要的化学成分之一，韭菜籽中含有药用功效的甾体皂苷（张新茹等，2009; 曹秀敏等，2015）。甾体皂苷具有镇静、催眠、降血糖和抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗抑郁等重要药理活性作用（张雪等，2020）。本研究鉴定的甾体皂苷是多星韭籽中下调幅度较大的差异代谢物，但KEGG PATHWAY数据库缺少修饰甾体皂苷的信息，本研究无法对其上下游代谢途径进行注释，通过查阅相关文献，构建了甾体皂苷的生物合成途径（张雪等，2020; 廖荣俊等，2020; 单春苗等，2020; 高琳，2020）。
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图8 多星韭籽与韭菜籽中甾体皂苷生物合成途径
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Fig.8 Biosynthetic pathway of steroidal saponinsins of Allium wallichii seeds and A. tuberosum seeds
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在本研究中，甾体皂苷的合成途径包括4个阶段。首先，经甲瓦龙酸途径（MVA）和甲基赤藓糖磷酸途径（MEP）（图8）通过焦磷酸化、脱羧化和脱水等过程生成中间原料异戊烯焦磷酸（IPP）; 其次，IPP通过法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鲨烯合酶（SS或SQS）和鲨烯环氧酶（SE或SQE）的催化形成氧化角鲨烯（OS），在环阿屯醇合酶（CAS）的催化作用下，生成甾体化合物的前体环阿屯醇; 然后，环阿屯醇经过一系列氧化还原修饰胆甾醇，胆甾醇环化为半缩酮，半缩酮C-26位的羟基在葡萄糖基转移酶催化下形成糖苷键，从而形成呋甾烷型甾体皂苷; 最后，呋甾烷型甾体皂苷经糖苷酶（F26G）催化水解C-26糖苷键生成螺甾烷型甾体皂苷。本研究检测到多星韭籽中丙酮酸、薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元、阿拉伯糖苷等显著上调表达，同时发现，2组样品间多种葡萄糖苷、多种鼠李糖苷、多种半乳糖苷以及木糖存在差异，推测其可能为形成甾体皂苷的底物或中间物质。
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甾体化合物是具有环戊烷多氢菲基本碳架的天然活性物质统称。皂苷是苷元为三萜类化合物或螺甾烷类化合物的一种糖苷，甾体皂苷主要有螺甾烷醇和呋甾烷醇，还有少量胆甾烷醇与孕甾烷型皂苷（于晶等，2020）。甾体皂苷作为植物中的一种重要次生代谢产物，具有巨大的开发前景和应用潜力，但由于产生甾体皂苷的植物多为多年生植物，生命周期长，甾体皂苷含量低，不能满足商业需求。本研究在多星韭籽与韭菜籽中共检测出36种甾体皂苷，可以作为甾体皂苷提取的新植物来源，通过进一步深入提取分离药理活性较高的甾体皂苷类化学成分，可实现生理活性物质的大量生产，有助于解决甾体皂苷植物资源短缺的问题，构建的韭籽甾体皂苷生物合成途径有助于了解不同种类药用植物中甾体皂苷代谢途径差异。
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本研究通过广泛靶向代谢组学技术对野生型多星韭籽与栽培型平韭6号韭菜籽成分进行广靶无偏分析，基于KEGG数据库对差异代谢物进行注释并获得了相应通路，构建了韭籽中生物活性物质甾体皂苷的生物合成途径，为韭籽有效成分及药理机理深入研究提供了一定的基础，为韭籽有效成分的代谢途径解析提供参考。本研究结果表明多星韭籽代谢物组成丰富，多种成分具有药理性作用，是很好的野生药用植物资源，可推动其自然野生资源的开发利用与保护，为进一步开发及利用多星韭植物资源提供理论依据。
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摘要
多星韭为贵州省赫章县喀斯特地貌区重要的野生植物资源之一,具有较高的开发利用价值。为分析野生多星韭(Allium wallichii )籽与栽培韭菜(A. tuberosum)籽代谢产物差异及其通路,该研究利用UPLC-MS/MS物质分离鉴定技术,对2种韭籽化学成分进行广泛靶向代谢组学分析。结果表明:(1)共检测到782种代谢产物。(2)主成分分析(PCA)显示样本间存在差异,正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)共筛选出12类显著变化(P＜0.05,VIP≥1)的差异代谢物,涉及492种,其中上调和下调幅度在前20的代谢物包括黄酮、甾体皂苷、黄酮醇、酚酸类、异黄酮、游离脂肪酸、三萜皂苷、生物碱、吲哚类生物碱、氨基酸及其衍生物等。(3)KEGG注释到84条差异代谢通路,其中差异代谢物显著富集(P＜0.01)通路4条,此外还构建了未注释到的显著差异代谢物甾体皂苷的生物合成通路。该研究结果为韭籽有效成分代谢途径解析及药理活性物质研究提供了参考,也为赫章县野生多星韭的开发保护与多元化利用提供了新思路。
Abstract
Allium wallichii is one of the important wild plant resources in the karst geomorphic area of Hezhang County, Guizhou Province, which has high development and utilization values. In order to analyze the differences of metabolites and their pathways between wild Allium wallichii seeds and cultivated A. tuberosum seeds, we used UPLC-MS/MS material separation and identification techniques to broadly target the chemical components of the two kinds of seeds for the metabolomic analysis. The results were as follows: (1) A total of 782 kinds of metabolites were detected. (2) Principal component analysis (PCA) showed that there were differences between samples. Orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) screened out 12 types of differential metabolites with significant changes (P＜0.05, VIP≥1), involving 492 kinds, among them, the top 20 metabolites with up-and down-requlation included flavonoids, steroidal saponins, flavonols, phenolic acids, isoflavones, free fatty acids, triterpenoid saponins, alkaloids, indole alkaloids, amino acids and their derivatives and soon. (3) KEGG annotated 84 differential metabolic pathways, of which four pathways were significantly enriched with differential metabolites (P＜0.01). In addition, the biosynthetic pathway of steroidal saponins, which were not annotated significantly differential metabolites, was constructed. This research result provides a reference for the analysis of the effective components of the two kinds of seeds and the study of pharmacologically active substances, and also provides new ideas for the development, protection and diversified utilization of wild A. wallichii in Hezhang County.
关键词
多星韭 ； 代谢组 ； UPLC-MS/MS ； 代谢通路 ； 甾体皂苷
Keywords
Allium wallichii ； metabolome ； UPLC-MS/MS ； metabolic pathway ； steroidal saponins
