枫香（Liquidambar formosana）是金缕梅科（Hamamelidaceae）枫香树属（Liquidambar L.）的彩叶落叶乔木，主要分布于秦岭淮河一线以南，广西全境都有分布。叶片春夏呈青绿色，秋季呈深红色，具有较高的观赏价值。枫香作为我国传统的药用植物，其树皮可用于通经活络，果子对于消化不良等病症有明显的作用，叶片有清热解毒的功效，更是广西壮族“三月三”传统节日中制作五色米饭不可或缺的重要材料。此外，枫香具有较高的用材价值，可用于制作家具或建材; 还具有维护地力的重要价值（范绍斌等，2021），其适应力强、耐贫瘠，对于一些有毒气体如Cl₂、SO₂有较强的抗性（赖玖鑫，2020），常作为生态结构、林种结构调整的重要树种，具有较高的研究价值。

近年来，转录组测序（RNA-seq）技术被广泛应用到分子生物学领域，逐渐成为分子生物学研究中最常用的技术（易浪波等，2017），基于转录组测序技术能够快速有效地获得基因序列，并从整体上揭示特定阶段物种基因功能及结构（刘佳奇等，2020）; 通过对转录组测序数据进行挖掘分析，可以得到SSR位点分布特征，从而为后期SSR引物的筛选和设计提供数据参考（叶鹏等，2019）。简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）又称为微卫星DNA，指由 1~6个核苷酸为重复单元串联组成的长达几十个核苷酸的重复序列。SSR在真核生物整个基因组内都有存在，具有数量丰富、多态性高、重复性好、特异性强的优点，被广泛应用于物种遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建（张利达和唐克轩，2010）、基因定位和分子标记辅助育种等研究（杨雄等，2021），被视为检测群体遗传多样性和群体间遗传分化最有效标记之一。按其来源可分为基因组SSR（G-SSR）和基于表达序列标签（expressed sequence tag，EST）的SSR两类。其中，G-SSR标记基于基因组序列，其开发过程繁琐复杂、成本高、效率低; 而EST-SSR标记基于表达序列标签，除具有G-SSR 标记的优点外，还具有序列保守性较高、在植物同属不同物种间有较好通用性的优点（王丹丹和杨东霞，2017）。

枫香作为我国重要的乡土树种，国内主要开展了生理性质分析（尹国平等，2021）、人工林培育（韦理电等，2016）及新品种（王建军等，2015）认定等研究。然而，在枫香群体遗传学方面的相关研究报道较少，其原因主要是缺乏足够的分子标记，以往对枫香遗传多样性的研究主要采用显性分子标记，如黄敏等（2021）探索了最适的枫香叶片DNA的提取方法，最优ISSR引物和最佳ISSR-PCR扩增反应体系; 毕则鑫等（2010）通过ISSR分子标记技术分析了枫香自然群体遗传多样性; 李芳芳（2015）优化了DNA提取及SRAP-PCR反应体系的方法等。相比较而言，SSR分子标记可揭示的遗传信息相对较高，明显优于其他传统分子标记（刘粉粉等，2021），而当前关于枫香SSR引物开发的报道相对较少。前人的研究主要采用磁珠富集法（顾辛韵，2016）和从NCBI获取数据的方法（孙荣喜，2017）来开发枫香SSR引物，这两个方法都存在获得位点信息较少、开发引物难度大、开发数量较少的问题，由此使得当前枫香SSR引物数量还不足以支撑更深入地进行枫香群体遗传学研究。

本研究以河池市7个县（区）及贵州荔波县为区域，依托转录组测序技术获得丰富且全面的枫香SSR位点信息，进行枫香EST-SSR引物的筛选和设计，随后采用PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法筛选出多态性好、扩增稳定的枫香EST-SSR引物，并通过对野生群体的遗传多样性分析以验证引物的应用效果。本研究拟讨论以下问题:（1）枫香SSR位点的具体分布及主要的序列特征;（2）枫香SSR引物的开发效率，以及影响开发效率的原因;（3）开发出的枫香SSR引物多态性情况及在枫香遗传多样性分析当中的应用效果。以期为今后枫香分子标记辅助育种、功能基因标记等提供基础依据，为枫香群体遗传学及遗传育种提供可靠研究工具，为进一步开展广西境内枫香种质资源遗传多样性评价等提供参考，为枫香育种材料遗传多样性及亲缘关系分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从广西河池市环江县随机选择1个枫香天然群体，采集其新鲜的红、黄、绿3种颜色的叶片分别装入50 mL离心管，并放入液氮中冷冻封存，交由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组测序。经查阅文献并实地考察，从广西河池市7个县（区）及贵州荔波县各选择1个枫香天然群体随机采集1个枫香样本（A1-A8）用作引物的初步筛选，另在8个天然群体中各采集2~4个枫香样本（各采样单株之间相距＞50 m），共计24个枫香样本（B1-B24）用作引物的复筛及多态性检测材料，从而保证实验材料能够覆盖该试验区更多天然群体及个体; 此外，在河池市环江县另选择1个枫香天然群体采集30个样本（C1-C30）用作遗传多样性分析的实验材料。材料具体来源如表1所示。

1.2 枫香转录组测序

主要从以下方面对测序过程进行把控。（1）样品质量检测:琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染; Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）; Qubit对RNA浓度进行精确定量; Agilent 2100精确检测RNA的完整性，从而保证RNA的完整性和总量。（2）使用Oligo（dT）磁珠富集的方法构建全长转录组文库:在PCR扩增富集合成cDNA时，通过循环优化确定PCR的最佳条件，从而保证文库构建质量; 经检验合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求运用PacBio Sequel平台进行测序，从而保证最终得到的SSR位点信息有效可靠。

1.3 枫香EST-SSR标记开发

对转录组测序挖掘到的枫香转录组中SSR位点进行筛选，筛选的标准是序列长度单位范围为16~28 bp，2个碱基单元的重复次数大于9次，3~6个碱基单元的重复次数为5次或大于5次，单碱基单元排除在外，上、下游引物退火温度差不超过3℃等，将符合条件的枫香转录组开发设计SSR引物，交由广州艾基生物有限公司进行引物合成。

1.4 枫香基因组DNA提取

使用快捷型基因组DNA提取系统提取枫香DNA（王茜等，2013），用分光光度计对提取后的DNA进行纯度与浓度检测，OD260/280比值应为1.7~1.9。随后，通过1%琼脂糖电泳检验DNA质量，将符合要求的模板DNA稀释到50 ng·μL^-1，放置于-20℃冰箱中备用。

1.5 PCR扩增

PCR扩增反应总体积为10 μL，其中包含2 μL DNA（50 ng·μL^-1），1 μL PCR Buffer（10×），0.2 μL dNTPs，上下游引物各0.25、0.07 μL Taq DNA Polymerase（5 U·μL^-1），以及6.23 μL的ddH₂O，该扩增反应在PCR仪上完成。SSR-PCR 扩增的程序:94℃预变4 min，94℃变性15 s，55℃复变性15 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸20 min，12℃保存。

1.6 引物有效性及多态性检测

将PCR扩增后的产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。实验步骤:使用移液枪吸取1.2 μL的滴加了溴酚蓝指示剂的扩增引物点在聚丙烯酰胺胶板上，凝胶首尾点1 μL 50~500 bp Marker，在240 V恒压下电泳，通过溴酚蓝指示剂调整电泳时间; 电泳结束后，将凝胶使用ddH₂O清洗2次，放入固定液中震荡10 min，随后取出凝胶放入超纯水中震荡清洗2~3次，每次2 min; 清洗后，将胶板放入银染液中进行银染，震荡7 min，银染后再次放入蒸馏水中震荡清洗2~3次，每次2 min; 将清洗后的凝胶放入显影液中震荡，直至胶板上出现清晰条带为止; 用ddH₂O 清洗凝胶2次后读条带，并拍照保存。

1.7 数据统计分析

人工进行条带判读，通过是否扩增出有效条带判断引物有效性。对具有有效性的引物，其不同扩增产物按条带长度从大到小用A、B、C······进行编号，汇总后通过Popgene32 软件计算以下参数:（1）观测等位基因数目（observed number of alleles，Na）;（2）有效等位基因数目（effective number of alleles，Ne）（Hartl et al.，1989）;（3）Shannon多样性指数（Shannon’s diversity index，I）（Shannon et al.，1949）;（4）观测杂合度（observed heterozygosity，Ho）;（5）期望杂合度（expected heterozygosity，He）（Nei et al.，1973）。通过PIC-CALC软件计算PIC（polymorphism information content）值（Botstein et al.，1980）。PIC值指多态信息含量，是判断SSR引物多态性的重要指标，当PIC≤0.25时，该位点为低度多态性位点; 当0.25＜PIC＜0.5时，该位点为中度多态性位点; 当PIC≥0.5时，该位点为高度多态性位点。计算PIC值所用到的公式（杨国忠等，2004）如下:

$PIC=1-\sum _{i=1}^n{P}_{\mathrm{i}}^2-\sum _{i=1}^{n-1}\sum 2P_{\mathrm{i}}^2{P}_{\mathrm{j}}^2$

式中:PIC指多态信息含量; P_i和P_j分别表示第i个和第j个等位基因频率; n表示等位基因数。

引物的有效扩增率指能够有效扩增的引物数量与引物总数量的比值。引物的多态性比率指具有能够有效扩增且多态性的引物数量与引物总数量的比值。

2 结果与分析

2.1 枫香转录组中SSR位点的分布特点

通过枫香转录组测序共挖掘到23 777个枫香SSR位点，平均每3.13 kb存在1个SSR位点。通过统计发现，枫香转录组中SSR主要有单核苷酸及二到六个核苷酸等6个简单重复单元类型。此外，还有少量复杂重复类型（表2），其中单核苷酸类型占SSR位点总数的46.54%，二核苷酸重复类型占SSR位点总数的33.10%，三、四、五、六核苷酸类型分别占SSR位点总数的17.80%、1.17%、0.49%、0.88%。单核苷酸类型中，出现频率最高的是T/A（66.81%），其次是A/T（24.99%）; 二核苷酸类型中，出现频率最高的是CT/AG（24.7%），较之稍少的是TC/GA（23.72%）; 三核苷酸类型中，出现最多的是CAG/CTG（6.17%），次之的是GAA/TTC（5.08%）; 四核苷酸类型中，出现最多的是TTTA/TAAA（17.2%）; 五核苷酸类型中，CTTTT/AAAAG（8.62%）出现频率最高; 六核苷酸类型中，出现最多的是ACCAGC/GCTGGT（4.72%）。可见，枫香SSR位点以单核苷酸、二核苷酸为主，共占SSR位点总数的79.64%，适用于设计引物的三到六核苷酸重复类型位点总数仅占位点总数的19.46%，限制了在此基础上开发枫香SSR引物的数量。

由表3可知，SSR重复次数在5~78次之间，主要集中在5~24次之间。其中，重复次数数量在SSR总位点数量中占比最多的是5~8次，共有8 787个，占SSR位点总数的36.96%; 排在第二位的是9~12次重复，共有8 417个，占SSR位点总数的35.40%; 重复次数在13~16次、 17~20次和21~24次的SSR位点数量分别为3 934个（16.55%）、1 830个（7.70%）和598个（2.52%）; 重复次数大于24次的最少，共有211个，仅占SSR位点总数的0.89%。在所有的重复次数当中，10次重复所占比例最大，有3 570个，占SSR位点总数的15.01%; 稍次之的是6次重复，共有3 220个，占SSR位点总数的13.54%。SSR位点的多态性由DNA复制过程中的滑动错配产生，SSR的重复次数越多，该位点的多态性往往越高，枫香SSR重复次数以5~8次为主，基本满足设计开发SSR引物的要求。

2.2 枫香EST-SSR引物有效性筛选

如表4所示，用8个枫香样本（A1-A8）DNA对262对引物进行简捷有效地初次筛选，有139对引物能够有效扩增，有效扩增率为53.1%，所设计的不同核苷酸重复类型的引物有效扩增率基本相同。因此认为，本研究所设计合成的各核苷酸重复类型引物在枫香群体具有一定的适用性。

2.3 枫香EST-SSR引物多态性分析结果

在筛选出的139对有效性引物中，能够扩增出多态性条带的引物有41对，多态性比率为15.64%，说明枫香SSR序列的保守性相对较强。选取其中18对扩增稳定、条带清晰、有多态性的引物（表5），对抽取的24个样本（B1-B24）DNA进行多态性检测，并用Popgene32 软件进行分析。

多态性分析结果显示，18个位点的观测等位基因数量（Na）介于2~5之间，平均值为3; PIC值介于0.30~0.72之间，其中10个位点的PIC＞0.50，具有高度多态性，其余8个位点的PIC＞0.25，具有中度多态性，不存在低多态性位点。所筛选出的18对枫香SSR引物具有较高的多态性。

2.4 枫香天然群体EST-SSR遗传分析有效性评价

用这18对引物对一个枫香天然群体的30个样本（C1-C30）DNA进行遗传多样性分析，扩增结果（表6）显示，18个位点共扩增出42个等位基因数，观测等位基因数介于2~4之间，平均值为2.333 3; 有效等位基因数（Ne）介于1.112 8~2.609 6之间，平均值为1.957 4; Shannon多样性指数（I）介于0.208 9~1.112 7之间，平均值为0.708 5; 观测杂合度（Ho）介于0.275 9~1.000 0之间，平均值为0.722 6; 期望杂合度（He）介于0.370 6~0.896 8之间，平均值为0.522 8。这表明所开发的18对SSR引物可用于枫香群体遗传多样性评价。

3 讨论与结论

3.1 枫香转录组SSR位点分布特征

SSR标记具有在植物种间通用性的优点，同属植物中移植已有标记进行开发SSR的研究已不少见（杨世鹏等，2018），而目前可用的枫香SSR引物较少，仅报道的有顾辛韵（2016）采用磁珠富集法开发的10对引物及孙荣喜（2017）通过NCBI数据库信息开发了11对引物。磁珠富集法主要是通过构建微卫星富集文库，经阳性克隆、筛选、测序最终得到SSR位点信息，这两个方法在一定程度上提高了SSR引物开发效率，但操作过程繁琐且需要构建和筛选基因组文库，开发难度较大，获得的SSR位点信息有限; 通过NCBI数据库开发SSR引物的方法使得研究者可以从中获得有效信息，节省了时间和成本，但当前数据库中的枫香序列数据有限，能获得的SSR位点信息较少且无法对枫香SSR位点信息分布特征进行详细描述。随着高通量测序技术的发展，RNA-seq测序的成本正逐渐降低，基于转录组数据开发EST-SSR分子标记，目前已成为基因发掘及分子标记开发的重要技术手段。本研究首次通过转录组测序技术获得了相对较多且较全面的枫香SSR位点信息。本研究发现，作为第三纪的孑遗植物，枫香转录组中SSR基元重复类型较为丰富，包含了6种核苷酸重复的所有类型，高比例的单核苷酸重复序列（46.54%）是枫香EST-SSR的重要分布特征，其重复基元分布类型与大花四照花（Cornusflorida）（刘佳奇等，2020）和黄枝油杉（Keteleeriadavidiana var. calcarea）相似（石远婷等，2021）。从整体来看，枫香转录组中SSR位点的数量和种类较为丰富，为枫香SSR引物开发及后续研究提供了重要基础。

3.2 枫香EST-SSR位点开发效率

本研究所设计的 262 对枫香EST-SSR引物有效扩增率为53.1%，祁雅等（2004）和魏利斌等（2008）研究指出的，所设计 EST-SSR 引物的有效扩增率应在60%~90%之间。本研究有效扩增率较低的原因可能有以下三方面:第一，三至六碱基重复类型的SSR位点占比较低（总计19.46%），使得可供筛选的SSR位点总量偏少; 第二，部分引物设计不合理，实验中所用引物均根据二代测序结果所得，二代测序在拼接过程中可能会存在一些错误，因而导致有效扩增率相对较低; 第三，开发的枫香SSR引物多态性比率较低（15.64%）。主要是由于SSR 的潜在多态性会随着SSR 基元重复次数的增多而增加（刘佳奇等，2020），而枫香主要基元重复次数为5~12次，并且主要基元以短重复类型为主，该SSR位点特征限制了枫香SSR的潜在多态性。内在原因主要是转录组SSR位点来自序列相对保守的基因编码区，其多态性位点一般位于功能序列的微卫星重复片段上，从而导致转录组SSR多态性较低（杨世鹏等，2018）。

3.3 枫香EST-SSR引物多态性及群体遗传分析有效性评价

衡量SSR引物可用性及多态性丰富度可以采用多态信息含量（PIC）、观测等位基因数（Na）及有效等位基因数（Ne）等参数。在多态信息含量指数方面，孙荣喜（2017）开发的14对枫香SSR引物中包括6个高度多态性位点、4个中度多态性位点、4个低度多态性位点。与前两者的研究相比，本研究开发的18对枫香SSR引物中，10对为高度多态性位点，8对为中度多态性位点，多态信息含量较高。在等位基因数方面，孙荣喜（2017）在全国范围内开展的中国枫香树遗传多样性及谱系地理研究中开发的14对枫香SSR引物，其观测等位基因数平均值为3.258 0，有效等位基因数平均值为1.848 0; 顾辛韵（2016）在千岛湖地区开展的片断化生境对枫香遗传多样性影响的研究中开发的10对SSR引物，观测等位基因数均值为4.6，有效等位基因数平均值为2.130 0。本研究所开发18对SSR引物在环江群体中检测到的观测等位基因数平均值为2.333 3，低于前两者，其原因是观测等位基因数在很大程度上依赖于抽取的样本大小，本研究采样范围及数量较前两者偏小; 有效等位基因数平均值（1.957 4），与前两者研究相近，而有效等位基因数比杂合体频率和纯合体频率更好地度量群体遗传变异地增加，说明该环江群体遗传多样性较为丰富。上述讨论说明本研究所开发的SSR引物同样能够很好地反映出枫香群体遗传变异情况，可适用于枫香遗传多样性研究。

引物开发的目的是得到多态信息含量高的SSR分子标记。由于前人研究中采用常规SSR分子标记开发技术获得的枫香序列有限，因此开发的枫香SSR引物数量较少、多态信息含量不高。本研究首次通过转录组测序技术对枫香SSR位点信息进行了较为全面的发掘，可高效地获得枫香某一发育时期细胞全部转录本信息，并克服了步骤繁琐、时间和人力成本高的问题。因此，自主设计枫香EST-SSR引物，并对其有效性及多态性进行验证，得到了18对尚未开发的多态信息含量较高的枫香EST-SSR引物，有效性评价结果显示这18对枫香SSR引物均可用于后续枫香的遗传多样性分析和种质资源保护的研究中，在前人研究基础上拓展了当前枫香SSR引物的数量和种类。由群体验证结果可知，不同的EST-SSR分子标记在群体表达上存在一定的差异，说明不同位点所在基因的进化速率存在差异，多态性较低的SSR位点多位于保守基因上（刘佳奇等，2020）。通过转录组测序技术开发的枫香EST-SSR引物除用于遗传多样性分析外，一方面可通过其位点特征回溯所在基因的固定或进化情况，以探究群体遗传分化问题; 另一方面结合转录组信息可开展位点所在序列基因功能性研究。既可用于构建优良表型关联的特异SSR标记，又可为后续深入开展枫香叶色变化分子机理、枫香药用活性成分的合成等研究提供一定的帮助，对枫香种质资源的开发、保存和利用具有重要的指导意义。

综上所述，本研究基于转录组测序技术获得了较为全面的枫香SSR位点信息，成功开发出18对枫香EST-SSR引物，对枫香中高度多态性SSR引物的数量提供了必要的补充，为解决当前枫香中高多态性SSR引物数量和种类不足以支撑更深入地进行枫香遗传多样性研究的问题提供了帮助，为枫香群体遗传学、分子辅助育种等研究提供了更多、更好的研究工具。

参考文献