植物在长期进化过程中，对外界的生物胁迫与非生物胁迫有系统的生理及分子响应机理。研究报道指出，胚胎发育晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA）与植物抗逆性相关，广泛参与植物对非生物胁迫的响应过程（李翔，2016）。LEA蛋白最初是在棉花种子中分离克隆得到的（Dure et al.，1981），之后研究发现LEA蛋白广泛存在于植物、无脊椎动物及原核生物中。LEA基因在植物的整个发育阶段均有表达，特别是在植物遭受如干旱，高温等环境胁迫时，LEA基因在植物组织细胞中大量表达，积累丰富的LEA蛋白以应对外界环境（Wise，2003; Silveira et al.，2008）。Hunault和Jaspard（2010）建立了LEA蛋白数据库（Late Embryogenesis Abundant Proteins database，LEAPdb），根据LEA蛋白氨基酸序列的8个保守的PFAM结构域对LEA蛋白成员进行生物信息学分析。通过LEA蛋白数据库确认研究中所提取的LEA蛋白的PFAM号，可以确定其所属的LEA蛋白家族，为后续实验提供理论依据。 LEA1（group 1 late-embryogenesis-abundant proteins）是以无规则结构形式存在的亲水性蛋白，在植物中广泛分布，典型代表为棉花D-19、小麦EM蛋白、大麦B19蛋白等。LEA1家族成员均具亲水性，各成员之间具有亲水性极高的20个氨基酸保守基序（GGETRKEQLGEEGYREMGRK），其数量多变（Stacy et al.，1995）。

在植物中克隆目的基因的启动子能进一步系统分析基因的功能。植物启动子是一段含有转录起始位点，调控基因表达的DNA序列，启动子的转录频率、起始方向和位点均是基因转录调控表达的关键（Liu et al.，1997; 王志新等，2011; 张曦予等，2019）。启动子主要包含一些特异性的调控基序（梅玉芹，2018），在结构和功能上可以分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子（杨瑞娟等，2018）。研究表明，诱导型启动子在外界环境因素发生改变时，会使基因瞬时或持续性上调表达（D'urzo et al.，2013）。Zheng等（2019）从卷心菜中分离得到了一个非典型LEA基因LpLEA基因及其启动子序列，分析表明中LpLEA基因的启动子中存在与非生物胁迫有关的独特顺式作用调控元件，LpLEA基因在不同非生物胁迫及脱落酸诱导下在不同部位表达量均提高。

垫状卷柏（Selaginella pulvinata）又名九死还魂草，主要分布于我国的干旱地区，常生长于裸露的石灰岩表面或者石缝中，具有很强的耐旱性，属于蕨类植物门垫状卷柏科垫状卷柏属土生或石生的复苏植物（吴征镒，2004）。研究表明，垫状卷柏具有独特的活性氧生成和清除调节途径，增强脱落酸生物合成和潜在的调节脱落酸信号及对脱落酸响应的机制，且经过叶绿体基因组分析发现其叶绿体结构具有独特的重排且叶绿体NAD（P）H脱氢酶（NDH）基因完全缺失（Saucedo et al.，2017）。因为LEA1蛋白可在植物幼苗时期受干旱、盐胁迫、ABA以及低温胁迫诱导表达，并且对植物体内乳酸脱氢酶的活性有保护作用，同时可正向调控部分钙依赖性蛋白激酶的表达（邹永东，2011; Xiang et al.，2018），所以LEA1蛋白作为参与植物耐受性调控的重要蛋白在高耐旱植物垫状卷柏中发挥的作用值得探究。但是目前，有关蕨类植物LEA蛋白的研究较少，而在蕨类植物垫状卷柏中LEA1基因的研究几乎为空白。因此，在垫状卷柏中克隆LEA1基因并分析其分子机制及表达特征，对其在垫状卷柏抗旱过程中的调控机制进行深入研究具有重要意义。本研究分离克隆了垫状卷柏SpLEA1基因，对SpLEA1基因序列及启动子顺式作用元件进行了生物信息学分析，构建了系统发生树和遗传距离矩阵，对同源蛋白序列进行了比对，并利用实时荧光定量技术检测了垫状卷柏幼嫩叶片不同干旱状态下的表达情况，可为进一步探索SpLEA1基因在干旱胁迫下的功能及分子作用机制奠定基础，同时，也可为园林园艺观赏植物的抗旱性改良提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

垫状卷柏采于云南省昆明市郊区，采集后进行培养箱培养（16 h日照; 25℃; 相对湿度20%）。采用垫状卷柏新鲜枝叶提取DNA和cDNA; 基因表达分析采用从岩石表层采集植株根部土壤含量较低的垫状卷柏植株，对实验材料根部充分浇水后，进行自然干旱处理，在处理时间点进行新鲜幼嫩枝叶采集，分为6个处理组，分别为0 h（根部充分着水，对照组）、自然干旱2、4、12、24 h和24 h后复水2 h组（复水组在干旱24 h后立即给予充足水分）。各处理组选取6个长势一致的植株，3个生物学重复，每个处理后的样本液氮速冻于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 SpLEA1基因DNA 的克隆

垫状卷柏总DNA的提取按照小量植物（叶）总DNA抽提试剂盒（北京天根生化公司）的说明书提取。根据本实验室转录组测序结果，设计SpLEA1基因全长引物（表1），以垫状卷柏DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系:DNA 模板 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 16 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH₂O 20 μL，终体积40 μL。PCR扩增程序:94℃，预变性，2 min; 94℃，变性，30 s，57℃，退火，30 s，72℃，延伸，90 s，38个循环; 72℃，延伸，10 min; 4℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测并使用凝胶回收试剂盒（OMEGA公司）纯化PCR产物，连接到克隆载体PMD18-T（宝日医生物技术）中，转化大肠杆菌（E. coli）DH5α（天根生化生物公司），经菌液PCR鉴定后送生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.2 SpLEA1基因cDNA 的克隆

垫状卷柏的总RNA按照总RNA提取试剂盒（OMEGA公司）的说明书提取。参照逆转录试剂盒（全式金生物技术有限公司）的使用说明书方法，使用提取的RNA作为模板进行逆转录反应。以垫状卷柏cDNA第一链为模板，进行PCR扩增（引物、PCR反应体系和程序同1.2.1相同），转化克隆、测序，获得cDNA全长。

1.2.3 SpLEA1基因启动子的克隆

以垫状卷柏DNA为模板，结合LEA1基因序列设计启动子特异引物SpLEA1Q1/2/3，分别作为第一、第二、第三轮特异引物，依次与随机引物组合，进行HiTail-PCR扩增，随机引物采用Liu和Chen（2007）设计的LAD1-1/2/3/4（表1）。选择第三轮产物进行电泳检测，将切取目的条带进行连接、转化、克隆后送去测序。

1.2.4 生物信息学分析

利用ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸的理化性质; 利用Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.）分析基因的结构信息; 利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点; 利用Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白亲/疏水性; 利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）进行二级结构预测及分析; 利用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）通过同源建模建立三级模型; 利用DNAMAN9 软件获得多序列结构域比对图并分析遗传距离矩阵; 利用MEGA X软件构建系统进化树; 利用在线软件PlantCARE（https://bioinformat-ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/heml/）对启动子顺式作用元件进行分析。

1.2.5 SpLEA1的qRT-PCR表达

利用qRT-PCR技术分析垫状卷柏SpLEA1基因在干旱胁迫处理下的表达，根据获得的垫状卷柏SpLEA1基因序列设计一对SpLEA1定量PCR引物，以卷柏Actin为内参基因（表1），以cDNA为模板，利用TB Green^© Premix Ex Taq^TMⅡ说明书（Takara，RR820A）进行qRT-PCR分析，每个样品3次重复以减小误差，反应程序:95℃，预变性，30 s; 95℃，变性，5 s，60℃，退火，30 s，40个循环。每个样品设有3次重复，采用2^-△△Ct法。

2 结果与分析

2.1 SpLEA1基因的克隆

以垫状卷柏总DNA为模板，结合引物SpLEA1-F/R进行PCR扩增，经测序鉴定获得全长475 bp的SpLEA1基因。以cDNA为模板，采用SpLEA1-F/R为引物，克隆获得279 bp的SpLEA1基因cDNA序列（图1:A）。测序结果表明，SpLEA1基因含有1个内含子（196 bp）和2个外显子（115 bp和164 bp），cDNA长度为279 bp，编码92个氨基酸（图1:B）。根据NCBI的PFAM数据库查询，得到SpLEA1蛋白在2~88氨基酸位点含有保守结构域LEA-5，PFAM号是PF00477，表明垫状卷柏SpLEA1基因属于LEA1家族。

通过SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线预测垫状卷柏SpLEA1蛋白质二级结构，由图1:C可知，α-螺旋占40.22%，β-转角占18.48%，无规则卷曲占36.96%，延伸链占4.35%，采用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在线工具进行同源建模，预测其三级结构。垫状卷柏SpLEA1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，β-转角和延伸链占比较小。

2.2 SpLEA1的生物信息学分析

通过ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）预测分析，SpLEA1基因编码蛋白质相对分子量为9 491.46 Da，理论等电点5.45，分子式为C₃₉₇H₆₅₉N₁₂₃O₁₄₂S₂，带负电荷（Asp + Glu）的残基总数为16，带正电荷（Arg + Lys）的残基总数为14。不稳定指数为28.72，该蛋白为稳定蛋白。SpLEA1蛋白含有Thr（4.3%）、Lys（9.8%）、Gln（5.4%）、Gly（18.5%）、Glu（13.0%）亲水性氨基酸，还含有Ala（12.0%）、Met（2.2%），Val（3.3%）、Ile（3.3%）、Leu（6.5%）疏水性氨基酸。经计算，亲水性氨基酸占51%，疏水性氨基酸占27.4%，平均亲水指数为-0.838。

通过Protscale（http://www.expasy.ch/tools/protscale.html）在线预测分析垫状卷柏SpLEA1蛋白的亲/疏水性。结果表明，小于0的亲水性氨基酸占多数，大于0的疏水性氨基酸只占少数，在第68位氨基酸有最大值为0.892，该处疏水性最强，在第43位氨基酸有最小值为-2.433，该处亲水性最强（图2），说明SpLEA1蛋白属于亲水性蛋白。

利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在线预测发现SpLEA1蛋白发生磷酸化修饰的位点共有10个。其中，丝氨酸有6个（Serine位点为3、29、57、66、67、86），而酪氨酸有3个（Tyrosine位点为19和25），苏氨酸仅有1个（Threonine位点56）。

用BLAST进行序列相似度分析，将垫状卷柏SpLEA1蛋白与鹰嘴豆、芝麻、黑麦等15种亲缘关系较近但物种不同的蛋白序列进行比对（图3）。多重序列比对（图3）结果显示，SpLEA1蛋白含有LEA-5保守结构域，并在遗传距离矩阵中发现，红车轴草和鹰嘴豆与垫状卷柏SpLEA1的遗传距离最近（为0.272），荠菜与垫状卷柏SpLEA1的遗传距离最远（为0.348）。利用MEGAX构建系统进化树，并使用DNAMAN进行遗传距离矩阵分析发现，垫状卷柏SpLEA1与鹰嘴豆（XP_004506729.1）和红车轴草（PNX91110.1）蛋白同源性较高，聚为一支（图4）。

2.3 SpLEA1基因的启动子克隆与功能元件分析

以垫状卷柏DNA为模板，进行HiTail-PCR扩增SpLEA1基因启动子序列，选择第3泳道约为2 000 bp的条带回收产物（图5），克隆获得SpLEA1起始密码子（ATG）上游2 018 bp的序列。使用PlantCare在线软件预测分析SpLEA1基因启动子中的顺式作用元件（图6，表2），发现SpLEA1基因启动子区含有核心启动子TATA-box和启动子增强子常见顺式作用元件CAAT-box; 含有光反应元件（I-box和G-Box）和大量与非生物胁迫有关的功能性顺式作用元件，其中有激素类的脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、赤霉素响应元件（GARE-motif和P-box）、水杨酸响应元件（TCA-element）及辅酶响应元件（TGA-element），还包含与干旱胁迫有关的功能性元件MYB及参与干旱诱导的MYB结合点（MBS）。根据以上结果可推测，SpLEA1基因的表达对垫状卷柏在干旱环境下的生存能力有显著影响。

2.4 SpLEA1基因qRT-PCR分析

利用qRT-PCR分析检测垫状卷柏SpLEA1在干旱胁迫下的表达模式。由图7可知，在自然干旱时间延长的过程中，SpLEA1呈现上调表达趋势，在干旱12 h时达到峰值，后呈现下降趋势，在干旱24 h后给予复水处理2 h，SpLEA1的表达量显著下降。根据以上结果可以推测，SpLEA1参与了垫状卷柏干旱胁迫的响应。

3 讨论与结论

在本研究中SpLEA1蛋白保守结构域为LEA-5（PF00477），属于LEA1家族。与NCBI中已收录的15个LEA蛋白进行序列对比，发现有2个保守序列在N端和C端出现，这与Battaglia 等（2008）的报道一致，在同源进化关系的分析中，没有检索到与SpLEA1蛋白相似度高的同属植物，但发现垫状卷柏SpLEA1与鹰嘴豆和红车轴草的Lea-5蛋白同源性较高，而在研究鹰嘴豆中CarLEA793和CarLEA4基因在干旱胁迫下保护植物细胞的分子机制，推进了LEA蛋白的耐旱性研究（顾汉燕，2010）。对大豆中LEA1蛋白结构研究表明，LEA1蛋白保守基序Em-C和Em-2M多肽在不同环境中的结构及聚集行为会发生改变，但都主要以无规则结构形式存在，这可能与Em蛋白在不同环境中的结构特点及其重要区域在整个蛋白中所起的作用有关（薛蓉等，2012）。邹永东（2011）研究发现，LEA1蛋白在应对不同环境时可以形成不同的空间结构，这些特殊的空间结构与α-螺旋相互作用，对细胞中的酶活性与蛋白质结构起到了保护作用。利用在线软件SOPMA和Swiss-Model对SpLEA1蛋白的二级结构和三级结构进行分析预测，结果表明SpLEA1蛋白主要结构是α-螺旋和无规则卷曲，与LEA1家族基因的结构特点一致，推测SpLEA1蛋白通过形成α-螺旋与无规则结构参与对垫状卷柏的干旱响应。在实时荧光定量结果分析中，可以看出SpLEA1基因在垫状卷柏干旱处理后出现表达上调的趋势，在干旱12 h时达到峰值，而在复水处理后表达量明显下降，反映了SpLEA1蛋白在受到干旱胁迫时会被诱导表达，这可能是垫状卷柏高耐旱性的原因之一。垫状卷柏SpLEA1基因的时空表达差异为后续过表达功能研究提供了基础。

本研究采用HiTail-PCR技术扩增SpLEA1基因启动子序列，利用在线软件PlantCare分析垫状卷柏SpLEA1基因启动子中的顺式作用元件，分析SpLEA1基因的转录表达水平，发现了核心元件TATA-box和CAAT-box，表明SpLEA1基因功能可以稳定表达; 对SpLEA1基因启动子功能元件进行分析，结果表明启动子区中含有大量的诱导型启动子，包含5类激素诱导表达元件和非生物胁迫诱导表达元件，其中与水分胁迫有关的元件有7个ABRE、4个MYB和4个MYC，与实时荧光定量实验中垫状卷柏在干旱处理后SpLEA1基因表达上调的结果相一致，反映了SpLEA1基因参与了干旱胁迫的应答响应。但是，关于SpLEA1基因抗旱性的作用机制有待进一步研究。

本研究从垫状卷柏中克隆获得SpLEA1基因cDNA全长序列，通过对其蛋白结构分析得出SpLEA1蛋白为亲水性稳定蛋白。根据对SpLEA1基因启动子的分离克隆和顺式作用元件分析结果推测SpLEA1基因在垫状卷柏耐旱机制中起作用，通过qRT-PCR表达实验观测到了在干旱环境中SpLEA1基因的高表达特性。因此，推测SpLEA1基因与垫状卷柏的高耐旱性有关，并参与了垫状卷柏在干旱胁迫下的表达调控。在后期的实验中，可以构建SpLEA1基因在酵母或拟南芥中的高表达载体，验证SpLEA1基因在原核和真核生物中的表达情况。对本研究的进一步探索可为植物抗旱基础研究领域提供一定依据，提高园林园艺经济观赏植物在干旱环境下的生存率。

参考文献