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火棘不同组织内生细菌群落多样性

  • 张丽芳1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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  • ，胡海林2

    机 构：

    2. 曲靖师范学院数学与统计学院，云南 曲靖 655011

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  • ，桂腾茸3

    机 构：

    3. 曲靖师范学院经济与管理学院，云南 曲靖 655011

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  • ，高秀1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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  • ，徐晴芳1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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  • ，朱铃1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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  • ，徐启贺1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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  • ，蔡建1

    机 构：

    1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011

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1. 曲靖师范学院云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南 曲靖 655011；
2. 曲靖师范学院数学与统计学院，云南 曲靖 655011；
3. 曲靖师范学院经济与管理学院，云南 曲靖 655011；

Diversity of endophytic bacterial community in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • ZHANG Lifang1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

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  • ，HU Hailin2

    Affiliation：

    2. College of Mathematics and Statistics, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

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  • ，GUI Tengrong3

    Affiliation：

    3. College of Economics and Management, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

    ×
  • ，GAO Xiu1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

    ×
  • ，XU Qingfang1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

    ×
  • ，ZHU Ling1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

    ×
  • ，XU Qihe1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

    ×
  • ，CAI Jian1

    Affiliation：

    1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China

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1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China；
2. College of Mathematics and Statistics, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China；
3. College of Economics and Management, Qujing Normal University, Qujing 655011 , Yunnan, China；

作者简介:

张丽芳（1987-），博士，讲师，研究方向为分子生物学和植物病理学，（E-mail）752859175@qq.com。

通讯作者:

蔡建，博士，副教授，研究方向为食品工程，（E-mail）272101475@qq.com。

中图分类号:Q939

文献标识码:A

文章编号:1000-3142(2023)07-1193-08

DOI:10.11931/guihaia.gxzw202206031

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目录contents

    摘要

    为了解火棘不同组织内生细菌群落多样性，该研究采用高通量测序技术对火棘内生细菌16S rRNA V5~V7可变区进行测序，分析火棘不同组织部位内生细菌群落多样性。结果表明：（1）从火棘根、茎、叶组织中共获得内生细菌OTU 1818个，其中根部754个，茎部 308 个，叶部756个，三者共有 OTU 152 个。（2）物种分类显示，不同火棘组织内生细菌具有丰富的群落多样性，火棘根部内生细菌种类隶属于23门53纲137目216科373属557种，其中异样根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）和链霉菌属（Streptomyces）为优势属，其相对丰度分别为 10.57%和 8.00%；茎部内生细菌种类隶属于21门32纲76目126科204属270种，其中马赛菌属(Massilia)和未知分类的丛毛单胞菌科属（unclassified_f_Comamonadaceae）为优势属，其相对丰度分别为31.10%和12.82%；叶部内生细菌种类隶属于21门52纲130目210科380属581种，其中土芽孢杆菌属（Geobacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属，其相对丰度分别为12.31%和9.84%。（3）PICRUSt功能预测表明，根部内生细菌物种最丰富，参与各种代谢调控的细菌丰度最高。该研究结果为进一步探讨植物内生细菌功能，挖掘新的有益微生物资源提供了参考。

    Abstract

    In order to understand the diversity of endophytic bacteria community in different tissues of Pyracantha fortuneana, the 16S rRNA V5-V7 variable region of endophytic bacteria in P. fortuneana was sequenced by high-throughput sequencing technology, and the diversity of endophytic bacteria community in different tissue parts of P. fortuneana was analyzed. The results were as follows: (1) A total of 1818 endophytic bacteria OTU were obtained, in which 754 endophytic bacteria were from root, 308 from stem and 756 from leaf, and with a total of 152 OTU. (2) Species classification showed that endophytic bacteria in different P. fortuneana tissues had abundant community diversities, and the endophytic bacteria in root belonged to 557 species, 373 genera, 216 families, 137 orders, 53 classes, 23 phyla, Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium and Streptomyces were the dominant genera, and their relative abundance was 10.57% and 8.00%, respectively. The endophytic bacteria in stem belonged to 270 species, 204 genera, 126 families, 76 orders, 32 classes, 21 phyla, Massilia and unclassified_f_Comamonadaceae were the dominant genera, and their relative abundance was 31.10% and 12.82%, respectively. The endophytic bacteria in leaf belonged to 581 species, 380 genera, 210 families, 130 orders, 52 classes, 21 phyla, Geobacillus and Pseudomonas were the dominant genera, and their relative abundance was 12.31% and 9.84%, respectively. (3) PICRUSt function prediction analysis showed that the species richness of root endophytic bacteria involved in te regulation of various metabolic pathways was the highest. These results provide a reference for endophytic bacteria functions and exploiting new beneficial microbial resources.

  • 火棘（Pyracantha fortuneana）为蔷薇科（Rosaeeae）常绿灌木野生果树植物，在云南地区分布广泛，具有适应性广、防风固沙能力强等生态价值，还是一种天然药食同源的水果资源（俞德浚和江万福，1974；李加兴等，2012；张俊辉，2014）。研究表明，在不同或相同植物的不同根、茎、叶、花、种子和根瘤等不同组织中均有内生细菌的存在，内生细菌与寄主植物之间在长期协同进化过程中建立一种和谐共处的平衡关系，不会导致植物侵染性病害发生，在植物体内形成微生态群落，对植物本身具有促生、抗病、抗虫、抗逆、内生固氮以及促进生防种质资源的研制与利用等多种生物学作用（樊剑波等，2008； Ownley et al.，2010; 李亮亮等，2017； Pham et al.，2017; Defez et al.，2017; Xu et al.，2017； 杨鑫等，2018），由此推测，内生菌常与火棘重要价值有关（Beckers et al.，2017; Suryanarayanan et al.，2017; 张爱梅等，2019）。目前，关于火棘内生菌的研究主要为火棘内生真菌的分离及抑菌活性测定，在火棘不同组织中共分离出15株（陈志敏等，2010），而关于火棘内生细菌研究目前尚未见报道。近年来，Illumina高通量测序技术的快速发展，对植物内生细菌多样性研究迅速崛起，该技术可直接从基因组DNA层面快速分析植物内生菌群落组成及多样性（Livak &Schmittgen，2001）。本研究以火棘根、茎和叶不同组织为研究对象，采用高通量测序技术探讨以下问题：（1）火棘内生细菌结构及多样性分析；（2）火棘内生细菌群落组成及差异分析；（3）火棘不同组织内生细菌功能预测。旨在为获得有益生防细菌信息资源奠定理论基础。

  • 1 材料与方法

  • 1.1 采集地概况

  • 火棘样品于2021年10月采自云南省曲靖市曲靖师范学院火棘试验田，地理位置坐标为103°72′ E、25°72′ N，海拔约为1 876 m。该地区位于云南省滇东北地区，属亚热带季风气候，气温为12~22℃，年均降水量在1 000 mm以上，其高海拔和低纬度是火棘生长得天独厚的自然生态条件。

  • 1.2 样品采集

  • 在采集地选择不同分布多位点的5株生长良好的火棘植株，将整棵植株小心挖出后抖落土壤，不伤害根系，并将植株立即放入无菌样品袋中，火棘根、茎、叶不同组织样品各3个重复，分别命名为HJG、HJJ、HJY，置于4℃环境下保存，并在48 h内进行表面消毒处理。

  • 1.3 样品处理

  • 称取相同重量火棘根、茎、叶不同组织样品，用自来水冲洗10 min，无菌纸吸干水分，75% 乙醇处理4 min，经无菌水洗涤后，用3% NaClO浸泡3 min，再用无菌水冲洗3~4次，最后一遍无菌水洗涤液经涂布牛肉膏蛋白胨培养基检测，确认无菌后，对样品内生菌基因组DNA进行提取（李亮亮，2021）。

  • 1.4 基因组 DNA 的提取及扩增测序

  • 采用FastDNASpinkit（MPBiomedicals）试剂盒对火棘不同组织样本进行总DNA的提取，经1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行PCR 扩增和高通量测序。本研究选用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）/1392R（5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′）和799F（5′-AACMGGAT TAGATACCCKG-3′）/1193R（5′-ACGTCATCCCCAC CTTCC-3′），该引物可在一定程度上避免寄主植物叶绿体和线粒体的污染（Bulgarelli et al.，2012; Lundberg et al.，2012; Bulgarelli et al.，2015）。通过PCR对火棘内生菌16S rRNA V5~V7可变区进行扩增。20 μL PCR反应体系为4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），0.8 μL 5 μmol·L-1上下游引物，0.4 μL FastPu Polymerase，1 μL 10 ng·μL-1 DNA模板，0.2 μL BSA，用dd H2O补充至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min后4℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用高通量技术进行测序。

  • 1.5 数据分析

  • 测序完成后，使用Flash软件对序列进行拼接并筛选有效序列，然后使用Uparse软件进行OTU聚类。通过Mothur和PICRUSt等软件对内生细菌进行Alpha多样性分析，代谢功能预测分析，从而获得火棘不同组织内生细菌功能相关信息。

  • 2 结果与分析

  • 2.1 火棘不同组织样品稀释曲线分析

  • 图1和图2反映了样品测序深度，检验本次测序结果是否真实准确地覆盖整个类群，图中横坐标表示样品reads数量，纵坐标表示OTU水平多样性指数。由图1可知，随着测序reads数量增加，火棘根茎叶内生菌Sobs指数有微上升趋势，表明火棘叶中仍有部分内生群落的种群尚未被检测，若增加测序量，会增加样本的OTU数量。但图2中Shannon稀释曲线显示，随着测序reads数量增加，火棘根茎叶内生菌Shannon指数已趋于平缓，说明增加测序量并不会增加样本的OTU数量。因此，基于现有测序数据得到的分析结果准确可靠。

  • 2.2 火棘不同组织内生细菌OTU聚类及其多样性分析

  • 由图3可知，通过对火棘不同组织内生细菌进行高通量测序并进行OTU聚类分析后共得到OTU数1 818个，其中，根的OTU数为754个，茎为308个，叶为756个，火棘的根、茎、叶共有的OTU数为152个，其中，茎、叶共有54个，根、叶共有256个，根、茎共有23个。

  • 通过对火棘不同组织内生细菌进行高通量测序后，由表1可知，不同组织内生菌有效序列条数不同，分别为根41 948条、茎37 180条、叶40 996条，基于OTU水平对不同组织内生菌进行Alpha多样性指数进行分析，其中Shannon指数和Simpson指数表示群落多样性，Shannon指数越高，Simpson指数越低表明内生细菌群落多样性越高，Chao1指数和Ace指数表示群落丰富度，指数值越高，说明群落丰富度越大。由表1可知，火棘不同组织内生菌群落多样性和丰富度存在差异，根部内生细菌的多样性和丰富度最高，茎部和叶部次之。

  • 2.3 火棘不同组织内生细菌种群归类分析

  • 对火棘根、茎、叶不同组织内生细菌物种分类阶层统计分析，火棘不同组织内生细菌一共可归类为29个门、71个纲、175个目、289个科和533个属和852个种。火棘不同组织内生细菌的分类阶层存在较大差别。由表2可知，其根部和叶部的内生细菌多样性最为丰富，茎部次之。

  • 2.4 火棘不同组织内生细菌群落组成及差异分析

  • 2.4.1 火棘不同组织内生细菌门水平群落组成分析

  • 由图4可知，所测3组不同组织样品中丰度较高的群落为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria），不同组织中优势细菌门丰度差异很大，其中根中为59.12%变形菌门、5.25%厚壁菌门和30.35%放线菌门，优势菌门为变形菌门和放线菌门；茎中为68.15%变形菌门、19.74%厚壁菌门和9.32%放线菌门，优势菌门为变形菌门和厚壁菌门；叶中为48.14% 变形菌门、31.56%厚壁菌门和14.26%放线菌门，优势菌门为变形菌门和厚壁菌门。

  • 表1 火棘不同组织内生细菌多样性指数分析

  • Table1 Diversity index analysis of endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 注: 同列数据后小写字母表示处理间存在显著性差异 （P＜0.05）。

  • Note: Lowercase letters in the same column indicates significant differences between different treatments (P＜0.05) .

  • 表2 火棘不同组织内生细菌物种分类阶层统计

  • Table2 Taxonomic rank statistics of endophytic bateria in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 2.4.2 火棘不同组织内生细菌科水平群落组成分析

  • 由图5可知，不同组织中优势菌科存在很大差别，在火棘根中优势菌科为15.30%根瘤菌科（Rhizobiaceae）、9.75%黄色杆菌科（Xanthobacte-raceae）、8.00%链霉菌科（Streptomycetaceae）和6.84%分支杆菌科（Mycobacteriaceae）和5.29%类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）；火棘茎中优势菌科为31.18%草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）、14.88%丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、7.18%假单胞菌科（Pseudomonadaceae）和6.17%葡萄球菌科（Staphylococcaceae）；火棘叶中优势菌科为13.07%芽孢杆菌科（Bacillaceae）、9.84%假单胞菌科、8.31%草酸杆菌科、7.33%黄色杆菌科、5.34%丛毛单胞菌科和5.22%乳杆菌科（Lactobacillaceae）。

  • 2.4.3 火棘不同组织内生细菌属水平群落组成分析

  • 由图6可知，不同组织中优势菌属存在很大差别，在火棘根中优势菌属为10.57%异样根瘤菌属、8%链霉菌属、6.84%分支杆菌属（Mycobacterium）、4.56%类诺卡氏菌属（Nocardioides）、5.28%慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）；火棘茎中优势菌属为31.1%马赛菌属、12.82%未知分类的丛毛单胞菌科属、7.18%假单胞菌属（Pseudomonas）、6.17%葡萄球菌属（Staphylococcus）；火棘叶中优势菌属为8.03%马赛菌属、12.31%土芽孢杆菌属（Geobacillus）、9.84%假单胞菌属、4.71%乳杆菌属（Lactobacillus）。

  • 2.5 火棘不同组织内生细菌KEGG代谢通路分析

  • 将所测的基因数据与KEGG数据库中的信息进行比对，从而获得火棘不同组织内生细菌的代谢通路相关信息（表3）。由表3可知，火棘内生细菌所有菌群参与的生物代谢通路有7类，包括新陈代谢细胞进程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢、生物体系统和未知分类，其中根部参与各种功能活动的内生细菌物种丰度相对较高，而茎部和叶部参与调控各种代谢的内生细菌丰度相对较低。

  • 3 讨论与结论

  • 本研究基于高通量测序技术，对火棘根、茎、叶不同组织内生细菌群落多样性进行研究。本研究结果表明，火棘不同组织内存在丰富的内生细菌，不同组织内生细菌在不同分类水平上的优势菌群、细菌多样性及丰度信息存在较大差异。植物内生菌具有自身独特的组织专一性，并且植物不同组织间内生菌多样性结构随植物的不同具有一定的差异（许国琪等，2020；顾美英等，2021），这种差异性可能与其自身所处生境的特殊性及其在长期适应环境过程中形成了自身独特的细菌群落特征。本研究中火棘不同组织内生菌共隶属于29个门71个纲175个目289个科533个属852个种，表现出丰富的生物多样性。在门分类水平上，变形菌门是火棘不同组织内的优势类群，在根部、茎部和叶部的丰度分别为59.12%、 68.15%和48.14%。在植物体内，变形菌门的物种和遗传多样性极其丰富，分布最为广泛，常被应用于植物病害防治和生物固氮（殷冬梅等，2013；李颖波等，2016；刘豪等，2019；李亮亮，2021）。同时，该菌门在火棘根、茎和叶中也占有较高的比例，在植物生长过程中可产生种类较多的抗生素（Kazuhide et al.，2014；李亮亮，2021），是一类非常重要的生防微生物。另外，根中分离到的链霉菌属具有抑制作用；异样根瘤菌属和慢生根瘤菌属具有固氮作用，这与张爱梅等（2021）的研究结果相同。火棘茎叶中含量最多的马赛菌属具有溶磷作用（Zhao et al.，2017），假单胞菌属和土芽孢菌属具有生防作用。

  • 图1 基于OTU水平的火棘不同组织内生细菌的Sobs稀释曲线

  • Fig.1 Sobs rarefaction curve for endophytic bacteria on OTU level in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 图2 基于OTU水平的火棘不同组织内生细菌的Shannon稀释曲线

  • Fig.2 Shannon rarefaction curve for endophytic bacteria on OTU level in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 图3 火棘不同组织内生细菌OTUs Venn图

  • Fig.3 OTUs Venn analysis on endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 图4 基于门水平的火棘不同组织内生细菌群落图

  • Fig.4 Community chart of endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana based on phylum level

  • 图5 基于科水平的火棘不同组织内生细菌群落图

  • Fig.5 Community chart of endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana based on family level

  • 图6 基于属水平的火棘不同组织内生细菌群落图

  • Fig.6 Community chart of endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana based on genus level

  • 表3 火棘不同组织内生细菌 KEGG代谢通路分析

  • Table3 KEGG metabolic pathway abundance of endophytic bacteria in different tissues of Pyracantha fortuneana

  • 对火棘不同组织内有效测序数和OTU数的研究表明，火棘根部内生细菌的有效测序数和OTU数目最多，多样性最为丰富，茎部和叶部次之，这与一些研究者研究结果相似，如对花生、水稻和小麦等研究中，根部的内生细菌多样性均高于其他组织（林标声等，2018；沙月霞，2018; Kiani et al.，2019；李亮亮等，2021），这可能与根部部分内生菌来源于土壤，土壤中的部分微生物可以进入火棘根系有关，但随着火棘植株的生长发育，土壤中的一些微生物进入火棘根系后没有继续沿维管束系统扩展，从而成为根部的独有物种。

  • PICRUSt基因功能预测分析表明，火棘不同组织中参与新陈代谢相关内生细菌的功能基因相对丰度最高，这可能与火棘含有丰富的氨基酸、维生素、果胶和可溶性糖等活性成分有关。另外，火棘内生细菌基因中也包含有维生素、氨基酸类、萜类、多糖和酮类及其他次生代谢产物等与植物成分生物合成有关的通路。这与赵柏霞和闫建芳（2023）研究结果相似。因此，通过获得火棘不同组织中内生细菌与有效化学成分合成的相关基因信息，协调火棘中有效成分生物合成和运输分解，为挖掘内生细菌资源提供一定的参考依据。

  • 参考文献

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  • 基本信息

    中图分类号: Q939
    文献标识码: A
    DOI: 10.11931/guihaia.gxzw202206031
    文章编号: 1000-3142(2023)07-1193-08

    基金信息

    云南省教育厅科学研究基金(2022J0808)；

    稿件历史

    收稿日期: 2022-11-10

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