植物内生真菌是指在植物的整个或某一生长阶段内，在健康植物组织或器官内寄居且进行繁殖，同时不会引起寄主植物发生明显感染症状的真菌（Porras &Bayman，2011）。此类真菌广泛存在于植物中，与寄主植物进化过程时建立协同进化、互利共生的关系（孙建慧，2018；任静，2020）。隋丽等（2021）的研究发现，植物内生真菌能增强植物光合特性，提高植物对营养元素的吸收率，并能提高植物在逆境条件下的抗胁迫能力以及产生植物激素来调节植物生长。同种内生真菌在不同宿主植物中所表现的作用和产生的次生代谢产物截然不同。

近年来，从植物内生真菌中分离出含有多种生物活性的天然代谢产物，包括生物碱、黄酮、醌类、环肽、萜类、甾体等化合物。这些化学成分可以表现出抗菌、抗虫、抗病毒等多种生物活性（Li et al.，2007；易晓华，2009；张亮等，2017；赵鑫等，2020；李慧媛等，2022）。植物内生真菌及其代谢产物在医药领域和农业病虫害生物防治方面均显示出重要的应用价值。吴启婷等（2022）从白术（Atractylodesmacrocephala）中分离出1株拟茎点霉属（Phomopsis sp.）内生真菌，对白术根腐病病原菌（Fusarium oxysporum、 F. solani、 F. incarnatum）有较强拮抗作用；陆洁淼等（2022）从西红花（Crocus sativus）中筛选出8株内生真菌，对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）有显著的拮抗作用，其中抑制效果最好的菌株经鉴定为栓菌属真菌变色栓菌（Trametes versicolor）；黄婷等（2019）从白屈菜（Chelidonium majus）中分离出刺盘孢属（Colletotrichum）和镰刀菌属（Fusarium）内生真菌，发现其代谢产物对苹果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米弯孢（Curvularialunata）、水稻稻瘟菌（Pyriculariaoryza）、烟草赤星菌（Alternaria alternate）和白菜黑斑菌（A．brassicae）均表现出抗菌活性；Cao等（2021）的研究发现，植物内生真菌提取物ZNC对马铃薯晚疫病具有超高的促生长、促产量和诱导的抗病活性。由此可见，植物内生真菌是抗植物真菌病害的生物源农药资源库。然而，目前对植物内生真菌的研究大多集中在药用植物的内生真菌上，而对于农作物内生真菌的研究却较少。

马铃薯（Solanum tuberosum）是继玉米、水稻、小麦之后的第四大粮食作物（马雪等，2014；邬时民，2015），其营养价值高、粮菜兼用，并且马铃薯面粉储备时间长，是国家粮食安全的重要保障。云南是我国西南地区主要的马铃薯产地，马铃薯产业已成为云南贫困地区农民脱贫致富的重要支柱产业（卢丽丽等，2018）。马铃薯产量及品质受真菌病害影响很大，目前主要使用化学农药对真菌病害进行防治，由于化学药剂会对环境及人畜健康造成极大威胁，因此生物防治已成为马铃薯真菌病害防控的研究热点。有研究发现，马铃薯内生菌对真菌病原体（尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌等）、细菌病原体（疮痂链霉菌、黄单孢菌）和内生毒素龙葵碱等有抑制作用（Sessitsch et al.，2004；王剑峰，2012；艾洪莲等，2017；郑旭，2019；张家欣，2022）。

本研究对云南省3个地区马铃薯的根、茎、块茎中内生真菌进行分离纯化，通过观察其微观形态和分析其ITS序列鉴定真菌，并在此基础上对内生真菌的组成及相关多样性指数进行分析和比较，拟探讨：（1）马铃薯内生真菌种群的多样性；（2）马铃薯不同组织部位内生真菌的分离率和定殖率；（3）不同地区内生真菌的优势菌属及不同部位内生真菌的多样性指数。本研究旨在丰富马铃薯内生真菌种群，为进一步深入研究这些内生真菌及代谢产物对马铃薯真菌病害的抑制作用提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

马铃薯健康植株于2020年5月采自云南省德宏芒市、大理喜洲和临沧双江。在盛花期采集完整植株，包括地上部分及地下部分。选取地上部分的主茎（冠层以下10 cm及露出土层外的上10 cm）及地下部分根（须状根）和块茎，主根长约40 cm，茎长80~100 cm，块茎大小为8 cm × 5 cm。采集完毕后，立即带回实验室进行后续马铃薯内生真菌的分离。

1.1.2 试验培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：成品培养基。MY培养基：21 g酵母麦芽浸粉肉汤，15 g琼脂，加蒸馏水至1 000 mL，121℃下灭菌20 min。

1.2 内生真菌的分离纯化

消毒：将马铃薯根、茎、块茎表面杂物用自来水反复冲洗3~4次后，用无菌水冲洗干净，沥干水分。将材料用无菌刀切成小段，置于50 mL无菌离心管中，依次用75%乙醇、无菌水和10 mL配置好的5% H₂O₂浸泡3 min，期间不断震荡，用无菌水冲洗3次。将经消毒后的组织置于无菌滤纸上，吸干表面多余水分后将根、茎、块茎切成5 mm × 5 mm的小块。为检验消毒是否彻底，依次设置2组对照：（1）吸取100 μL最后一次清洗组织块的无菌水至新鲜无菌PDA培养皿上，用无菌涂布器涂布均匀；（2）使用按压法，将消毒的组织块放至新鲜无菌PDA平板上，稍加按压，放置20 min后移去组织块，每组处理设置3个平行。将以上2种不同方法处理的对照置于26℃培养箱中进行培养，观察有无菌落长出，以明确组织块消毒是否彻底。

分离纯化：将准备好的小组织块采用组织块接种法（韦艳梅等，2016），等距离放在含有氨苄青霉素（50 mg·mL^-1）和卡拉霉素（10 mg·mL^-1）的MY培养皿中，每个培养皿放置8~10个组织块，待培养皿做好标记后倒置，放于26℃生化培养箱中培养，培养7 d左右，期间不定期观察组织下方或边缘处是否有菌落出现；根据菌落生长形态、颜色和时间等，采用尖端菌丝挑取法（吴小平等，2009），及时将单个菌落的新鲜菌丝挑出，转接到30 mm PDA培养皿中，倒置于26℃生化培养箱中培养观察。反复多次转接培养以获得形态一致的单一菌落，即为纯化好的内生真菌菌株。将其转接到60 mm培养皿中，标记名称及转接日期，放置在26℃培养箱中培养3~10 d，平板没有污染，待长满培养皿后于4℃冰箱保存。

1.3 内生真菌的鉴定

1.3.1 形态学鉴定

挑取少量各菌种菌丝体置于载玻片上，添加乳酸酚棉兰染色液，使菌丝染色，同时使用接种针将菌丝挑拨松散后从一侧缓慢盖上盖玻片，并在蔡司显微镜下观察，记录显微镜下各菌株菌丝的形态特征。根据传统的形态学鉴定方法，结合《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）和《真菌的形态和分类》（戴芳澜，1987）等参考资料对内生真菌菌株进行初步鉴定。

1.3.2 分子生物学鉴定

用改良的CTAB法对马铃薯内生真菌菌株进行DNA提取（张妙彬等，2009）。参考易天凤等（2019）的方法，利用内生真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对真菌的ITS序列进行扩增。PCR反应体系为30 μL，包括模板DNA 2 μL、引物1×2 μL、2×Taq PCR MasterMix 15 μL、ddH₂O 11 μL。PCR反应扩增程序：99℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸7 min。

将琼脂糖电泳检测合格后的目的产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，登录NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），将ITS测序结果上传至NCBI核酸序列数据库与已知序列进行比对，选择相似性高的序列进行分析。利用MEGA 7.0软件，采用邻接法（neighbor joining）构建系统进化树。

1.4 内生真菌数据分析

1.4.1 定殖率（colonization rate，CR）

定殖率 = 在培养基中分离出的内生真菌组织块数/所有组织块数×100%（Kátia et al.，2016）。内生真菌的定殖率反映了宿主植物不同组织部位中受内生真菌侵染的程度。

1.4.2 分离率（isolation rate，IR）

分离率 = 培养基中分离的内生真菌总株数/总分离组织块数×100%（康茜，2017）。内生真菌的分离率反映了宿主植物不同组织部位中内生真菌存在的丰度。

1.4.3 分离频率（isolation frequency，IF）

指某一指定类型真菌的菌株数量占分离培养的内生真菌菌株数量的百分率，用于比较和判断优势菌群（柴新义等，2016）。

1.4.4 香农多样性指数（Shannon-Wiener index，H′）

反映了分离的内生真菌中的物种丰富度。香农多样性指数可用以下公式计算，即

$H^{\mathrm{\text{'}}}=-\sum _{i=1}^k{P}_i\times \mathrm{l}\mathrm{n}{P}_{i\circ }$

式中： k 指某种植物或组织中内生真菌种类的总数；P_i表示植物组织中分离出来的某一种内生真菌的株数占分离得到的总菌株数的百分数（Zhao et al.，2020）。

2 结果与分析

2.1 马铃薯内生真菌的分离

2.1.1 不同地区马铃薯内生真菌分离情况

不同组织部位间马铃薯内生真菌的分离数量有一定差异性，利用组织块分离法和尖端菌丝挑取法，从云南省德宏芒市、大理喜洲、临沧双江3个地区马铃薯组织样品中共分离出98株内生真菌（表1）。其中，从来自德宏芒市的马铃薯样品中分离出40株、从来自大理喜洲的马铃薯样品中分离出27株、从来自临沧双江的马铃薯样品中分离出31株，分别占总分离株数的40.82%、27.55%、31.63%。

2.1.2 内生真菌定殖率和分离率

分离得到的98株内生真菌中，有44株来自根部、14株来自茎部、40株来自块茎（表2）。由表2可知，根、茎、块茎中内生真菌的定殖率分别为68.33%、65.00%、76.67%，表明块茎中内生真菌定殖率最高。马铃薯根部、茎部和块茎中内生真菌的分离率分别为73.33%、23.33%、66.67%，表明根部分离率最高。马铃薯组织中内生真菌总定殖率和总分离率分别为70.00%和54.44%。

2.2 马铃薯内生真菌的鉴定

2.2.1 内生真菌的分子生物学鉴定

挑选出测序成功的14株不同种的内生真菌的ITS序列上传至NCBI数据库中进行核酸序列BLAST比对，选择和测序序列相关性比较高的序列进行分析，表3结果表明，这14种内生真菌大部分属于子囊菌门和担子菌门，涵盖10个目13个属，并且ITS序列和GenBank相似性均在99%以上。基于内生真菌ITS rDNA序列所得的14株菌株的系统进化树如图1所示。

2.2.2 内生真菌的形态学鉴定

过形态学观察（菌落观察和显微镜下菌丝体观察）（图2）及分子生物学技术（ITS）鉴定，98株内生真菌多为子囊菌门和担子菌门，包含13属14种（表4），分别为构巢曲霉（Aspergillus nidulans，M1）、褶皱裸孢壳（Emericellarugulosa，M2）、局限青霉（Penicillium restrictum，M3）、长极链格孢（Alternaria longissima，M4）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum，M5）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum，M6）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum，M7）、Pseudopyrenochaetaterrestris（M8）、Plectosphaerellaplurivora（M9）、毛韧革菌（Stereumhirsutum，M10）、Colletotrichum boninense（M11）、Psathyrellasulcatotuberculosa（M12）、Epicoccumcatenisporum（M13）和Cercosporamusigena（M14），分别将其命名为M1-M14。

2.2.3 内生真菌的组成分析

通过形态学观察（菌落观察和显微镜下菌丝体观察）及分子生物学技术（ITS）鉴定，98株马铃薯内生真菌包含13属14种（图3），分别为曲霉属（Aspergillus）、裸孢壳属（Emericella）、青霉属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、木霉属（Trichoderma）、须壳孢属（Pseudopyrenochaeta）、小不整球壳属（Plectosphaerella）、韧革菌属（Stereum）、刺盘孢属（Colletotrichum）、脆柄菇属（Psathyrella）、附球菌属（Epicoccum）和尾孢菌属（Cercospora）。其中，镰刀菌属真菌占15.3%、青霉属占13.3%、曲霉属占12.2%。

2.3 不同地区内生真菌优势种群分析

从不同地区、不同组织部位中分离得到的内生真菌在种类和数量上存在明显区别（图4）。德宏芒市的马铃薯样品中，内生真菌优势属为青霉属和曲霉属，分离频率为30.00%和25.00%。分离于根部的内生真菌优势属为曲霉属，IF为35.29%；分离于茎部的内生真菌优势属为青霉属和链格孢属，IF均为37.50%；分离于块茎的内生真菌优势属为青霉属，IF为33.30%（图4：A）。

大理喜洲的马铃薯样品中，内生真菌优势属为裸孢壳属和刺盘孢属，分离频率为29.63%和18.52%。分离于根部的内生真菌优势属为裸孢壳属，IF为35.71%；分离于茎部的内生真菌优势属为附球菌属，IF为100.00%；分离于块茎的内生真菌优势属为刺盘孢属，IF为45.45%（图4：B）。

临沧双江的马铃薯样品中，内生真菌优势属为韧革菌属，分离频率为29.03%。分离于根部的内生真菌优势属为韧革菌属，IF为46.15%；分离于茎部的内生真菌优势属为附球菌属，IF为75.00%；分离于块茎的内生真菌优势属为小不整球壳属，IF为28.57%（图4：C）。

此外，研究还发现脆柄菇属内生真菌仅能从根部分离得到，在根部的分离频率为6.81%。

2.4 不同部位内生真菌的多样性指数分析

马铃薯不同组织部位中的内生真菌多样性指数（ H′）各不相同且呈现出一定规律（表5）。由表5可知，德宏芒市马铃薯样品各组织中，内生真菌多样性指数表现为H′_根（1.42）＞ H′_块茎（1.26）＞ H′_茎（0.78）；大理喜洲马铃薯样品各组织中，内生真菌多样性指数大小表现为H′_根（1.51）＞H′_块茎（1.28）＞H′_茎（0.28）；临沧双江马铃薯样品中，各组织内生真菌多样性指数大小表现为H′_根（1.29）＞H′_块茎（1.12）＞H′_茎（0.49）。由此可见，马铃薯根部内生真菌的多样性指数高于茎部和块茎。

Bootstrap=1 000，节间数字代表Bootstrap支持值; bar代表遗传距离; M1-M14为本研究所分离的菌株，其余的序列均来自GenBank数据库。

Numbers at the branches indicate the percentages of trees from 1 000 Bootstrap replication in which the branch occurs; M1-M14 are the fungi isolated in this experiment, the other sequences are all from Genbank database.

3 讨论与结论

受真菌生活环境的影响，一些真菌的菌落形态特征十分相似，采用传统形态学分类方法对内生真菌进行鉴定和分类存在很大难度，要求鉴定者有相当丰富的经验。因此，观察真菌的生长环境、对比真菌菌落菌丝形态以及将显微结构特点与现代分子生物学技术相结合的方法，是更为准确可靠的鉴定手段。本研究从云南3个地区（德宏芒市、大理喜洲、临沧双江）的马铃薯根、茎和块茎中共分离到内生真菌98株，使用传统分类学结合ITS序列分析的方法将其归为13属14种，多为子囊菌门和担子菌门，优势属为镰刀菌属和青霉属，其他菌属分别为曲霉属、裸孢壳属、链格孢属、木霉属、须壳孢属、小不整球壳属、韧革菌属、刺盘孢属、脆柄菇属、附球菌属和尾孢菌属。艾红莲等（2017） 从马铃薯内生真菌中分离到链格孢属、镰刀菌属和附球菌属。谢佳伟等（2021）从云南的87株烟草中分离出内生真菌103株，其中优势菌属也包含镰刀菌属；李盼盼等（2018）从湖北的健康烟草中共分离到539株内生真菌，镰刀菌属为优势菌属，说明镰刀菌属广泛存在于茄科植物中。此外，本研究中分离鉴定的褶皱裸孢壳、接骨木镰刀菌、毛韧革菌、Psathyrellasulcatotuberculosa和Epicoccumcatenisporum 5种内生真菌均为首次从马铃薯植株中分离得到。

续表4

本研究采用组织块分离法共分离了180块马铃薯组织块，长菌的组织块为126块，总定殖率为70%，对于马铃薯内生真菌总定殖率尚未见有学者报道，而李晓娜等（2009）对于橡胶树中内生真菌的研究显示，总定殖率为91.94%，结果高于本研究，这可能与材料本身的科属有关，马铃薯为茄科一年生草本植物。橡胶树为大戟科多年生木本植物，由于马铃薯生长周期较短，外界的微生物侵染率低，导致其定殖率较低；而橡胶树生长周期长，外界的微生物侵染率高，因此它的定殖率高。从不同组织的分离数量来看，块茎定殖率最高，说明马铃薯块茎中受内生真菌侵染度最高，这可能与地下部分的微生物活动及养分有关联；根部分离率最高，说明马铃薯根部分离得到的内生真菌属丰度最高，这可能与土壤中微生物含量和种类有关系。不同地区（来源）及不同组织中内生真菌多样性指数趋势均为H′_根＞H′_块茎＞H′_茎，这可能是茎部采自马铃薯地上部分，根部和块茎采自马铃薯地下部分，而空气中内生真菌感染率要比土壤中内生真菌感染率低。李盼盼等（2018）对湖北烟草不同组织中内生真菌多样性表现的研究结果为H′_茎＞H′_叶＞H′_根，与本结果相反，说明不同地区不同物种植物中内生真菌的组织偏好性不一样。

本研究发现，各组织中分布的内生真菌种类差别较大，德宏芒市马铃薯样品中优势菌为青霉菌，大理喜洲马铃薯样品中优势菌为翘孢霉菌，临沧双江马铃薯样品中优势菌为韧革菌。此外，一些常见的内生真菌（如链格孢属、镰刀菌属）在茎和根中均能分离得到，而Psathyrella仅能从根部分离到，韧革菌属不能在茎中分离到。刘宏玉等（2021）对烟草的研究发现，叶点霉属（Phyllosticta）只分布在其叶中，而Fusarium不能从叶中分离得到，说明内生真菌具有组织的专一性和特异性（Huang et al.，2008）。

本研究从云南省3个地区的马铃薯样品中分离得到98株内生真菌，其中5种内生真菌为首次从马铃薯植株中分离得到，丰富了马铃薯内生真菌种群，为马铃薯内生真菌多样性的研究提供了准确的参考数据。后期，将进一步进行内生真菌拮抗马铃薯病原真菌的活性筛选，并对其次生代谢产物进行化学成分和抗菌活性研究，期望获得结构新颖的高活性物质，为马铃薯真菌病害的生物防治提供科学基础和依据。

参考文献