玄参科（Scrophulariaceae）隶属于唇形目（Lamiales），全球分布。玄参科为多而杂的一个大类群，缺乏特征性性状将其与其他相关类群进行区分，基于形态的经典分类时期，分类学家们将诸多类群归于玄参科，致使玄参科一度成为唇形目中物种数目最丰富的科。而鉴定性性状的缺失也暗示了玄参科可能不是一个单系。最早的采用分子系统学研究玄参科的系统发育可以追溯至上个世纪末，Olmstead和Reeves（1995）基于两个叶绿体片段，对玄参科是否为单系进行了研究，结果表明玄参科不是一个单系类群。Olmstead 等（2001）基于三个叶绿体基因的分析结果表明，广义玄参科[Scrophulariaceae s.l.（sensu lato）]至少包括了5个单系类群，即狭义玄参科[Scrophulariaceae s. s.（sensu stricto）]、Veronicaceae、列当科（Orobanchaceae）、Calceolariaceae和Stilbaceae。更多相关研究的进行，使得广义玄参科被拆分，原本隶属于玄参科的物种并入了其他科或形成了许多小科，如Calceolariaceae、母草科（Linderniaceae）、通泉草科（Mazaceae）、列当科、泡桐科（Paulowniaceae）、Schlegeliaceae、狭义玄参科和美丽桐科（Wightiaceae）等（Oxelman et al.，2005; Rahmanzadeh et al.，2005; Tank et al.，2006; Liu et al.，2020）。

狭义玄参科可以划分为8个族，即Aptosimeae、Buddlejeae、Hemimerideae、Leucophylleae、Limoselleae、Myoporeae、Scrophularieae和Teedieae，其中除Scrophularieae主要分布于北温带外，主要分布于南半球（Oxelman et al.，2005; Tank et al.，2006）。

据中国植物志英文版（Flora of China），玄参科包括约220属4 500余种，我国有61属681种。《中国植物志》所采用的玄参科的范畴，即为上文所述广义玄参科。前人关于广义玄参科的研究多采用少数叶绿体片段，所获得的系统发育关系，部分支系的支持率不够高，如车前科（Plantaginaceae）、玄参科和紫葳科（Bignoniaceae）的单系仅得到中等支持率的支持；紫葳科、马鞭草科（Verbenaceae）、爵床科（Acanthaceae）和狸藻科（Lentibulariaceae）等的关系并没有得到很好的解决（Liu et al.，2020）等，因此有待进一步的研究。本文基于质体基因组数据，以广义玄参科及相关类群为主要研究对象，利用质体基因组数据中的蛋白质编码基因，重建其系统发育树，对原隶属于广义玄参科相关物种的归属问题进行研究，并对唇形目内部科间关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究数据

从GenBank数据库下载已发表的玄参科及相关类群107属129个物种的质体（包括叶绿体基因组）序列及蛋白质编码基因（coding sequence， CDS）（表1）。物种挑选的原则为隶属于广义玄参科的物种均包括在内；除此之外，参考已发表相关文献下载了同隶属于唇形目相关科的部分物种，包括木犀科（Oleaceae）、苦苣苔科（Gesneriaceae）、狸藻科、爵床科、胡麻科（Pedaliaceae）、马鞭草科、紫葳科、唇形科（Lamiaceae）、透骨草科（Phrymaceae）和列当科等，其中木犀科不属于核心唇形目（core Lamiales），而苦苣苔科据文献记载与广义玄参科关系较远，因而这两个科虽然已发表的物种序列较多，而本研究中下载的物种数较少，其余的科，下载的种属均较多，母草科、狸藻科等包括物种较少的原因为目前可获得已经公开发表的种属数目较少。

选择夹竹桃科（Apocynaceae）的长春花（Catharanthus roseus，KC561139.1）、龙胆科（Gentianaceae）的蓝玉簪龙胆（Gentiana veitchiorum，MG192310.1）及茜草科（Rubiaceae）的团花（Neolamarckia cadamba，MG572117.1）共3个物种，作为外类群。用Excel统计内类群所有物种的基因组信息，包括基因组大小及蛋白质编码基因数目。

1.2 构建矩阵

基于蛋白质编码基因，我们构建了用于后续系统发育分析的矩阵。每个物种的蛋白质编码基因按基因名称的字母进行排序和连接，采用在线软件MAFFT version 7（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）（Katoh et al.，2019） 进行比对，参数设置为默认值。比对结果采用MEGA 7.0软件（Kumar et al.，2016）进行部分人工校正，并对矩阵的长度、变异位点的数目等信息进行统计。

1.3 系统发育分析

基于所获得的矩阵，分别采用最大似然法（maximum likelihood，ML）及贝叶斯推断（Bayesian inference，BI）进行系统发育分析。采用CIPRES Science Gateway （Miller et al.，2010）在线工具RaxML ver.8.2.12（Stamatakis，2014）进行RaxML分析，选择GTRGAMMA模型，采用快速靴代值（rapid bootstrap）分析，重复1 000次（bootstrap，BS）。采用CIPRES Science Gateway（Miller et al.，2010）在线工具MrBayes v 3.2.7a （Ronquist &Huelsenbeck，2003）进行贝叶斯推断分析，选择GTR+GAMMA模型。BI分析的参数设置如下：采用MCMC（Markov chain monte carlo）算法，运行1 000 000代，每1 000代取样一次，开始的25%样本作为老化样本（Burn-in samples）舍弃，以剩余样本构建主要规则一致树，并计算各分支的后验概率（posterior probability，PP）。

2 结果与分析

2.1 基因组大小

我们共下载了132个物种的基因组序列（包括外类群），其中127个为质体全基因组序列，5个为部分基因组序列，包括Neobartsia inaequalis、裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）、Calamphoreus inflatus、Glycocystis beckeri和柳穿鱼（Linaria vulgaris）（表1）。由表1可知，这5个部分基因组序列中，柳穿鱼的基因组序列较短，CDS数目仅为13，其余4个物种的基因组序列较完整，CDS数目在82~87之间。质体全基因组数据中，列当科的Conopholis americana CDS数目最少为21个，紫葳科的Anemopaegma acutifolium具有最多的CDS，其数目为98。

续表1

注： ★表示物种隶属于广义玄参科。

Note: ★ indicates the species is originally placed in Scrophulariaceae s. l.

全基因组序列中，除列当科和狸藻科之外，所有物种的基因组序列大小均在144~168 kb范围内。其中列当科的物种基因组大小变化幅度大，在45~160 kb之间，这与列当科植物的生活习性相关，其所包括的自养类群基因组较大，而寄生类群，由于其与光合作用相关的基因丢失（Cusimano &Wicke，2016），使得其基因组较小，相应的CDS数目也较少。而狸藻科由于其食虫习性，ndh基因丢失（Wicke et al.，2013），基因组相对于自养类群而言较小，在140~150 kb之间，CDS数目在72~88之间。

2.2 矩阵信息

本研究包括的132个物种中，CDS数目≤50的物种数目为14个，其中13个物种为列当科物种，其余118个（89.39%）物种的CDS数目均≥70。构建矩阵需考虑的方面有两点，一是信息位点的数目，二是缺失数据的比例。采用共享CDS来构建系统发育树，可以减少矩阵中缺失数据的比例，但可能导致数据量太少，可利用的信息位点数目较少。前人研究结果表明在构建系统发育树时，相比较数据量小而缺失数据比例低的矩阵而言，数据量大的矩阵虽然其包括了较高比例（80%或90%）的缺失数据，但由于总的信息位点数目的增加，仍能够较好地解决物种间的系统发育关系，包括提高系统发育树的支持率（Roure et al.，2013; Tripp et al.，2017）。因此，本研究构建矩阵，利用的是物种的全部CDS，这种方法在缺点在于比对之后的矩阵中某些物种中存在数据缺失，优点在于增加了序列的长度。基于CDS所构建的矩阵，长度为183 488 bp，其中变异位点数目为55 152（30.06%），信息位点数目为32 932（17.95%），缺失数据比例为60.83%。

2.3 广义玄参科的系统发育分析

基于ML及BI分析，本研究较好地解决了玄参科及相关类群的系统发育关系，得到了拓扑结构稳定，且支持率高的系统发育树。支持率方面，在ML树中，总分支数目为129个，支持率（bootstrap support，BS）≥95的分支数目为112（86.82%），支持率≥70的分支数目为123（95.35%），支持率≤50的分支数目仅为3（2.33%），全部位于列当科内部。

拓扑结构方面，广义玄参科不是一个单系类群（图1），隶属于广义玄参科的51个物种（37属）分散于列当科、泡桐科、美丽桐科、通泉草科、母草科、狭义玄参科和车前科，其中8属保留在狭义玄参科，29属从广义玄参科移出。来江藤属（Brandisia）、火焰草属（Castilleja）、胡麻草属（Centranthera）、小米草属（Euphrasia）、钟萼草属（Lindenbergia）、山罗花属（Melampyrum）、马先蒿属（Pedicularis）、松蒿属（Phtheirospermum）、地黄属（Rehmannia）、阴行草属（Siphonostegia）和呆白菜属（Triaenophora）共11属从原广义玄参科移至列当科。泡桐属（Paulownia）从广义玄参科移出，独立为泡桐科。美丽桐属（Wightia）从广义玄参科移出，独立为美丽桐科。野胡麻属（Dodartia）、肉果草属（Lancea）和通泉草属（Mazus）从广义玄参科移出，形成通泉草科。蝴蝶草属（Torenia）从广义玄参科移出，并入母草科。Antirrhinum、Aragoa、假马齿苋属（Bacopa）、毛地黄属（Digitalis）、鞭打绣球属（Hemiphragma）、兔耳草属（Lagotis）、柳穿鱼属（Linaria）、Littorella、胡黄连属（Neopicrorhiza）、车前属（Plantago）、婆婆纳属（Veronica）、腹水草属（Veronicastrum）共12属从广义玄参科移出至车前科。

狭义玄参科为单系类群（BS=100，PP=1.00）（图1），包括10属15个物种，除原隶属于广义玄参科的Bontia、Calamphoreus、Diocirea、Eremophila、Glycocystis、Leucophyllum、玄参属（Scrophularia）和毛蕊花属（Verbascum）外，还包括了醉鱼草属（Buddleja）和苦槛蓝属（Myoporum）。其中，醉鱼草属原隶属于马钱科（Loganiaceae），苦槛蓝属原隶属于苦槛蓝科（Myoporaceae）。

本研究中包括的物种涉及了狭义玄参科的4族，Buddlejeae包括醉鱼草属2个物种，Scrophularieae包括玄参属2个物种和毛蕊花属2个物种，Leucophylleae包括Leucophyllum一个物种，Myoporeae包括了剩余的6属。除Leucophylleae（仅包括一个物种）外，其余3族均为单系（BS=100，PP=1.00），Buddlejeae和Scrophularieae互为姐妹群，Leucophylleae和Myoporeae关系较近，为姐妹群。

2.4 唇形目内部科间系统发育关系分析

唇形目为一个单系（BS=100，PP=1.00），目下共形成了14个支持率高的单系分支，对应于14个科（其中美丽桐科和胡麻科仅包括一个物种，不包括在内）（图1）。这16个科中，最先分化出来的类群为木犀科，其余的科构成核心唇形目；核心唇形目为单系（BS=100，PP=1.00），类群分化次序为苦苣苔科、车前科、狭义玄参科、母草科；其余的科形成2个支持率高的大分支（BS=100，PP=1.00），其中一个大分支包括5个科，紫葳科、马鞭草科和胡麻科形成中等支持率的一个分支（BS=88，PP=1.00），其中紫葳科、马鞭草科关系较近，为姐妹群；爵床科+狸藻科亦形成中等支持率的一个分支（BS=74，PP=0.99）；另一个大分支包括了6科（列当科、泡桐科、透骨草科、美丽桐科、通泉草科和唇形科），这一支中，最早分化出来的类群是唇形科，其次是通泉草科，继之是透骨草科+美丽桐科，列当科+泡桐科形成的姐妹群为最晚分化的类群。

3 讨论与结论

3.1 广义玄参科的多系起源及其裂解

本研究基于质体基因组数据，重建玄参科及其相关类群的系统发育关系，获得高支持率的系统发育树，结果表明广义玄参科为多系起源，其所属物种分散于列当科、泡桐科、美丽桐科、通泉草科、母草科、狭义玄参科和车前科，与前人基于叶绿体片段及核基因数据的结果基本一致（Olmstead et al.，2001; Oxelman et al.，2005; Rahmanzadeh et al.，2005; Tank et al.，2006; Liu et al.，2020）。

传统分类中，列当科为寄生草本类群。本研究中，隶属于广义玄参科的11属分散于列当科中。其中，地黄属和呆白菜属为姐妹群，共同组成了列当科的基部类群，与Albach 等（2009）基于叶绿体片段及ITS序列的结果一致。Olmstead 等（2001）基于3个叶绿体片段的研究结果表明，钟萼草属、火焰草属、山罗花属和马先蒿属应从广义玄参科移出至列当科。Bennett和Mathews （2006）基于核基因PHYA 的研究结果表明松蒿属、阴行草属、小米草属应隶属于列当科。McNeal 等（2013）基于2个叶绿体片段及2个核基因的结果确定了胡麻草属在列当科内部的系统位置。

关于泡桐属的研究，Olmstead 等（2001）的研究结果表明，泡桐属不属于玄参科也与紫葳科没有关系，支持其形成一个独立的支系。

关于美丽桐属的研究，Liu 等（2020）基于6个叶绿体基因，确定了美丽桐属在唇形目的位置，并建议成立美丽桐科。

肉果草属和通泉草属主要分布于亚洲的东部和东南部，在Beardsley和Olmstead（2002）的研究中，建议将这两个属从玄参科移出，并入透骨草科，成为其中一个族（Mazoideae）；之后，Albach 等（2009）基于四个叶绿体片段及ITS序列的结果表明，肉果草属和通泉草属应从透骨草科移出；继之，Deng 等 （2019）基于叶绿体及核基因数据结果支持通泉草科作为单系类群存在，其下包括肉果草属、通泉草属和野胡麻属三属。

Olmstead 等（2001）的研究结果中，建议将Antirrhinum、毛地黄属等类群从广义玄参科移出，形成Veronicaceae；基于此研究结果，Albach 等（2005）进一步的研究建议将Veronicaceae修改成车前科（Plantaginaceae），而广义玄参科的Antirrhinum、Aragoa、假马齿苋属、毛地黄属、鞭打绣球属、柳穿鱼属、Littorella、车前属、婆婆纳属、和腹水草属应隶属于车前科。兔耳草属和胡黄连属一直以来都被认为是车前科的成员，但在上述研究的采样中，均未包括在内，Zhang等（2019）和 Cheng等（2020）基于叶绿体基因组数据，支持这两个属隶属于车前科。

狭义玄参科内部的系统发育关系，与前人的研究结果基本一致（Oxelman et al.，2005; Tank et al.，2006），即Buddlejeae和Scrophularieae关系较近，Leucophylleae和Myoporeae关系较近，支持率有所提高（BS=100，PP=1.00），鉴于本研究所取狭义玄参科种属较少，仅包括8族中的4族，物种数也较少，在此不作详细论述。

3.2 唇形目内部科间的系统发育关系

本研究中，广义玄参科的物种，分散于列当科、泡桐科、美丽桐科、通泉草科、母草科、狭义玄参科和车前科7科，其中车前科为唇形目中较为基部的类群，而列当科为进化的类群，因而一定程度上，关于广义玄参科的系统发育研究，与唇形目的系统发育研究息息相关。本研究中涉及唇形目16科，各科之间的关系与前人的研究结果基本一致，Liu 等（2020）基于6个叶绿体片段对唇形目美丽桐科的系统位置进行了研究并重建了整个唇形目的系统发育树，狭义玄参科为单系类群，获中等支持率（BS=78，PP=0.94），属于核心唇形目，其与车前科及Stilbaceae、Byblidaceae+母草科等类群关系较近。本研究基于质体基因组数据获得的系统发育树的拓扑结构与Liu等（2020）的研究结果基本一致，但在支持率上有明显的提高，平均支持率为96.06，支持率≥95的分支占86.82%，≥70的分支占95.35%，支持率低于50的分支均在唇形科内部。科间关系得到较好解决，仅有3处支持率低于95的分支，分别是紫葳科与马鞭草科+胡麻科形成的分支（BS=88，PP=1.00）、爵床科和狸藻科形成的分支（BS=74，PP=1.00）和通泉草科所在这一分支（BS=82，PP=0.99），其系统发育关系有待进一步研究。

参考文献