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黄草乌（Aconitum vilmorinianum）为毛茛科（Ranunculaceae）乌头属（Aconitum）蔓乌头系（Ser. Volubilia）多年生草本植物，分布于云南中部、四川（会理）及贵州西部，生于海拔2 100~2 500 m的山地灌丛中（中国植物志编辑委员会，1979）。其药用部位为根，有剧毒，主要含有滇乌碱等多种二萜类生物碱，具有祛风散寒、活血止痛、解毒消肿等作用（李雪佩等，2017），是云南红药、虎力散和百宝丹等云南著名伤科类药物的主要原料药之一（曾礼芳等，2021），有极高的药用价值。黄草乌用药需求大，最初主要依靠野生资源，但过度采挖造成了分布区域锐减和野生资源枯竭。近年来，黄草乌的人工驯化栽培获得成功（字淑慧等，2012），在云南的泸西、建水、个旧、东川、禄劝、丽江、巧家等地区有较大规模栽培种植，有效解决了资源供应问题。然而，我们对几个栽培基地的药材进行主要毒性成分含量进行分析时发现，滇乌碱的含量不稳定，另一特征成分黄草乌碱甲的含量波动范围则更大（董帅等，2020）。黄草乌作为乌头类毒性药材，质量稳定尤为重要，因此对其质量影响因素的研究很有必要。
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黄草乌药材来源在1974年和1996年版的《云南省药品标准》中规定：草乌（Radix Aconiti Vilmoriniani）为毛茛科植物黄草乌（A. vilmorinianum）或滇南草乌（A. austroyunnanense）的块根（云南省卫生局，1974；云南省卫生厅，1996），2005年版的《云南省中药材标准》仅收录了黄草乌一种植物来源，并修订药材名为黄草乌（Radix Aconitum Vilmoriniani）（云南省食品药品监督管理局，2013）。《云南植物志》（中国科学院昆明植物研究所，2000）中记载，黄草乌与滇南草乌在形态上十分相近，黄草乌花期8—10月，滇南草乌花果期10月，块根均供药用，民间用于治疗风寒湿痹、中风瘫痪、跌打损伤等疾病，用途基本相同。我们发现不同地区种植的黄草乌药材有黄皮黄芯、紫皮黄芯和紫皮紫芯几种情况，花的形态也略有不同。通过调研了解到，黄草乌的种植来源中有一部分是种植户在基地附近采挖的野生品，并未明确其植物基原。由此可见，黄草乌在栽培过程中可能存在种源混杂的情况，进而导致药材质量不稳定。乌头属植物种类较多，种间界限模糊，形态相似难以区别（朱高倩等，2020），受外部环境影响，植株形态、花色花型、根的数量及根皮颜色等在种内会有差异，仅依靠传统形态学鉴定、理化性质鉴定、显微特征鉴定等方法不能准确区别乌头类植物（童玉懿等，1986；罗艳和杨亲二，2005；肖培根等，2006；周成蕾，2013）。因此，利用分子生物学手段明确黄草乌植物基原，可从源头保障药材质量。
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叶绿体是多数高等植物和少部分藻类及原核生物进行光合作用和生命代谢活动的重要细胞器，是半自主性细胞器，拥有自己的基因组，也就是叶绿体基因组（chloroplast genome）（王仕奇等，2022）。叶绿体基因组对于筛选药用植物密切相关物种的分子标记以及破译亲缘关系较近植物类群间的系统发育关系具有重要贡献（Jansen et al.，2007; Wicke et al.，2011; 姜汶君等，2020）。近年来，新一代测序技术发展迅速，测序成本逐年降低，已经有越来越多的叶绿体基因组成功发表，推动着分子生物学研究的迅速发展（Shinozaki et al.，1986; Ohyama et al.，1986）。前人利用内转录间隔区ITS（张富民等，2003；Luo et al.，2005）、psbA-trnH序列（朱高倩等，2020）等构建了乌头属植物的系统发育关系，在亚属水平上基本能说明其亲缘关系。然而一些研究结果表明，亚属下分类群的划分与传统划分不一致；叶绿体基因组可以作为 DNA 超级条形码对植物物种进行准确鉴别。樊东昌等（2022）虽然通过叶绿体全基因组序列构建了乌头属的系统进化树，但并未囊括乌头属的大部分物种。
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本研究以采集到的10个黄草乌栽培品为材料，对他们的完整叶绿体基因组序列进行测序、组装、注释，揭示其基本序列和结构特征，同时结合32个已发表乌头属物种的叶绿体基因组序列分析10个栽培品的系统发育关系。拟探讨以下科学问题：黄草乌的种植栽培是否确实存在种源混杂的客观情况，进而导致了黄草乌药材质量的不稳定。本研究将明确黄草乌的栽培种源问题，并为黄草乌的基原植物鉴定、规范化种植、合理开发利用等研究提供一定数据。
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1 材料与方法
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1.1 实验材料
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黄草乌栽培品采自禄劝县干海子撒营盘、泸西县三塘乡、巧家县药山镇、宁蒗县永宁乡等栽培基地（表1），选择健康植株，采集新鲜嫩叶并用干燥硅胶保存。
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1.2 叶绿体DNA提取与测序
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使用Bio Teke公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取新鲜幼嫩叶片全基因组DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技有限公司）检测DNA纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测合格后送往上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA文库构建，并采用Illumina HiSeq 4000 高通量测序平台进行测序。
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1.3 叶绿体基因组组装、注释和物理图谱绘制
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测序获得的原始数据（raw data）用软件NGS QC Toolkit（Patel &Jain，2012）进行过滤，使用默认参数，除去低质量的reads后获得待组装序列（clean reads）。参考乌头属黄草乌A. vilmorinianum（NC_038094）的叶绿体基因组序列，利用NOVOPlasty（Dierckxsens et al.，2017）软件对10个栽培品的clean reads进行de novo组装，k-mer值设置为39。采用在线注释软件Annotation Tool GeSeq（Tillich et al.，2017）进行注释，并在Geneious R11.1.5软件（Kearse et al.，2012）中进行人工校对。将叶绿体基因组序列导入OGDRAW-Draw（Greiner et al.，2019）在线工具，绘制叶绿体基因组物理图谱，带有完整注释信息的cpDNA序列上传于GenBank数据库中，并获得相应的登录号（DC-2-2，OP227195；GJ-1-3，OP227196；JS-1-4，OP227197；LJ-1-2，OP227198；LJ-3-2，OP227199；LJ-4-3，OP227200；LQ-1-3，OP227201；LX-1-3，OP227202；NL-1-3，OP227203；QJ-1-2，OP227204）。
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1.4 全叶绿体基因组特征分析
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使用在线工具MISA（Beier et al.，2017）对各序列的简单重复序列（SSR）进行检测，参数设置为单核苷酸（mono-nucleotide）SSR≥10，二核苷酸（di-nucleotide）SSR≥5，三核苷酸（tri-nucleotide）SSR≥4，四核苷酸（tetra-nucleotide）SSR≥3，五核苷酸（penta-nucleotide）SSR≥3和六核苷酸（hexa-nucleotide）SSR≥3。
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1.5 全叶绿体基因组比较分析
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使用IRscope在线工具（Amiryousefi et al.，2018）对10个栽培品叶绿体基因组4个区域边界进行差异分析。以黄草乌为参考序列，使用mVISTA（Frazer et al.，2004）在线工具，采用shuffle-LAGAN模式进行乌头属叶绿体基因组全序列比对。采用DnaSP（Rozas et al.，2017）软件测定10个栽培品叶绿体基因组的核苷酸多样性（nucleotide diversity，Pi），参数如下：每步滑行200 bp（step=200 bp），窗口长度600 bp（window length=600 bp）。
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1.6 系统发育分析
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为探讨10个栽培品之间的进化关系以及在乌头属植物中的系统发育位置，从美国国家生物信息中心（NCBI）下载了32个已发表的乌头属叶绿体基因组序列，此外还选择1种飞燕草属（Consolida）植物C. orientalis（NC_047292），1种翠雀属（Delphinium）植物还亮草[D. anthriscifolium（MK253461）]作为外类群，用以构建系统进化树（表2）。采用MAFFT v.7.0进行全序列比对（Katoh &Standley，2013），同时选择最大似然法（maximum likelihood，ML）和贝叶斯法（Bayesian inference，BI）进行系统发育分析以增加结果的可信度，ML树在软件Phylosuite（Zhang et al.，2020）中进行构建，自展值设置为1 000次，BI树同样使用Phylosuite软件进行构建，共运算2 000 000代，根据马尔科夫链的蒙特卡洛模拟算法（Markov chain Monte Carlo，MCMC），以随机树作为起始树，每运算1 000代抽样一次。舍弃burn-in阶段25%的老化样本，并且在平均标准差降低至0.01以下时，用剩余的样本构建多数一致树。
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2 结果与分析
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2.1 叶绿体全基因组基本结构特征和分类
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与大多数被子植物的叶绿体基因组结构相类似，10个栽培品叶绿体基因组全长155 744 bp（LJ-1-2）~155 937 bp（DC-2-2）（图1），呈典型的四分体环状结构，即一对反向重复区（inverted repeat，IR）将整个环状的叶绿体基因组分为一个大单拷贝区（large single copy region，LSC）和一个小单拷贝区（small single copy region，SSC），其大小分别为26 170~26 236 bp、85 453~86 548 bp、16 921~17 007 bp，10个样品的叶绿体基因组十分保守，不仅大小和结构相似，而且GC含量均为38.1%，都具有明显的AT偏向性。此外，叶绿体基因组注释结果（表3）显示，10个样品叶绿体基因组内容和顺序基本一致，均含有131个基因，其中包括蛋白质编码基因85个、转运RNA基因（tRNA）37个和核糖体RNA基因（rRNA）8个。
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10 个栽培品的基因根据各功能的不同可以分为4大类：（1）与转录翻译相关的基因；（2）与光合作用相关的基因；（3）其他基因；（4）未知功能基因。与转录翻译相关的基因包括核糖体蛋白亚基基因、RNA聚合酶基因、rRNA基因和tRNA基因，其中tRNA基因数量最多；与光合作用相关的基因主要有光系统I基因、光系统II基因、NAD（P）H氧化还原酶基因、细胞色素b/f复合体基因、ATP酶基因和二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因，其中光合作用系统基因数量最多；其他基因共6个；未知功能基因8个。在这些基因中含有21个双拷贝基因，包括2个核糖体大亚基（rpl2、rpl23）、2个核糖体小亚基（rps7、rps12）、4个rRNA基因（rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23）、7个tRNA基因（trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC）、1个NADH脱氢酶（ndhB）、3个未知功能基因（ycf1、ycf2、ycf15）（表4）。
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注： — 表示在电子版《中国植物志》中找不到该物种的种中文名。
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Note: — indicates that the Chinese name of this species can not be found in the electronic Flora Reipublicae Popularis Sinicae.
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2.2 全叶绿体基因组SSR分析
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10 个栽培品的叶绿体基因组中共发现60个（LJ-1-2）~73个（JS-1-4）SSR位点（图2：A），包括28~37个单核苷酸SSR位点、13~16个二核苷酸SSR位点、6~9个三核苷酸SSR位点、6~9个四核苷酸SSR位点、2~5个五核苷酸SSR位点，未发现六核苷酸SSR位点，单核苷酸重复占比最大（44.4%~51.5%）。单碱基重复单元A/T、C/G，二碱基重复单元AT/TA，三碱基重复单元AAT/ATT、ATC/ATG，四碱基重复单元AAAG/CTTT、AAAT/ATTT和AATG/ATTC、AATT/TTAA，五碱基重复单元AATAT/ATATT是10个样品共有的SSR（图2：B）。10个栽培品的叶绿体基因组中SSRs的分布有所不同（图2：C），LSC区含有534个SSRs，SSC区含有42个SSRs，IR区含有88个SSRs，不同样品SSRs在3个区域的占比也不尽相同：LSC区为78.6%~83.1%，SSC区为10.8%~14.7%，IR区为5.6%~8.6%。
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2.3 IR 边界扩张和收缩分析
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本研究比较了10个栽培品叶绿体基因组的IR区边界，结果见图3。10个样品的叶绿体基因组长度在155 744 bp（LJ-1-2）~155 937 bp（DC-2-2）之间，IR区域的长度为26 127 bp（DC-2-2）~26 170 bp（JS-1-4、QJ-1-2、LX-1-3、LJ-4-3），LSC区域的长度为 86 496 bp（LJ-1-2）~86 680 bp（DC-2-2），SSC区域的长度为16 921 bp（LJ-3-2）~17 007 bp（LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3、DC-2-2），所有样品的LSC、SSC和IR区域的大小相似，IR区与SC区边界高度保守，但各样品叶绿体基因组的IR区和其他样品间仍略有差异。10个样品的rps19基因均距离IRb区63 bp；除LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3、DC-2-2 4个样品的rpl2长度为1 486 bp外，其余样品的rpl2长度均为1 490 bp；ndhF基因距离IRb/SSC边界113~119 bp；所有样品的ycf1基因均横跨SSC区和IRa区，并且ycf1基因大部分位于SSC区（4 012~4 027 bp），均有1 286 bp位于IRa区；在10个样品中IRa/LSC边界均处于rpl2和trnH基因间，trnH基因距离IRa/LSC边界120~126 bp。
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图1 10个栽培品全叶绿体基因组物理图谱
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Fig.1 Physical map of complete chloroplast genome in 10 cultivated varieties
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2.4 全叶绿体基因组比对分析
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以黄草乌为参考，使用mVISTA在线工具对10个栽培品的叶绿体基因组进行全序列比对，以分析10个栽培品的叶绿体基因组序列差异。由图4可知，10个栽培品的基因组高度保守，其中，IR区更为保守，编码区相较于非编码区更保守。此外，10个栽培品叶绿体基因序列中存在一些高变区段，主要是基因间隔区trnK-UUU-trnQ-UUG、trnC-GCA-trnT-GGU、trnT-UGU-trnL-UAA、atpH-atpI、trnP-UGG-psaJ、rbcL-accD、ycf4-cemA、rpl16-rps3以及基因rpl20、ycf1等。
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使用滑动窗口计算高度可变区域的核苷酸多样性，以估计所分析的10个栽培品叶绿体基因组中不同区域的差异水平。由图5可知，核苷酸多样性的变化范围为0~0.009 15，核苷酸多样性大于0.006的是基因间隔区trnY-GUA-trnE-UUC、ccsA-ndhD、petD-rpoA以及基因trnS-GCU、ycf1、rpl16、ndhF，基因间隔区ccsA-ndhD变异率最高，核苷酸多样性值为0.009 15，高变异率位点主要位于LSC和SSC区，IR区未发现变异率高的片段，以上结果与mVISTA在线工具分析结果一致。
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2.5 乌头属植物系统发育分析
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为了探索不同种植基地的黄草乌之间的亲缘关系，结合10个栽培品叶绿体基因组序列以及从NCBI下载的32条乌头属序列和2条外类群物种的序列，基于两种数据集（全叶绿体基因组序列和蛋白质编码基因序列）分别采用两种不同的方法（ML和BI）构建系统进化树（图6，图7）。结果均显示，42条乌头属序列聚在同一大支，整个乌头属分为3个亚属（露蕊乌头亚属、牛扁亚属和乌头亚属），露蕊乌头亚属为基部类群，10个栽培品均属于乌头亚属。以不同数据集建立的进化树在拓扑结构上存在细微差异，基于叶绿体全基因组构建的系统发育树均显示，LJ-1-2与铁棒锤（A. pendulum）等3个物种聚为分支a，支持率（99/1），与宾川乌头（A. duclouxii）亲缘关系较近；LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3和DC-2-2与滇南草乌（A. austroyunnanense）聚为分支b，支持率（100/1）；LJ-4-3与马耳山乌头（A. delavayi）、丽江乌头（A. forrestii）等3个物种以（100/1）的支持率聚为分支c，与马耳山乌头亲缘关系较近；JS-1-4、QJ-1-2、LX-1-3以及LJ-3-2与黄草乌（A. vilmorinianum）和瓜叶乌头（A. hemsleyanum）聚为分支d，与黄草乌有着较近的亲缘关系。而基于蛋白质编码基因序列构建的系统进化树均显示，LJ-1-2与苍山乌头（A. contortum）聚为分支a，支持率（88/1）；LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3和DC-2-2与滇南草乌聚为分支b，支持率（100/1）；LJ-4-3与西南乌头（A.episcopale）、马耳山乌头等4个物种以（74/1）的支持率聚为分支c，与西南乌头亲缘关系较近；JS-1-4、QJ-1-2、LX-1-3以及LJ-3-2与黄草乌聚为分支d。
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3 讨论与结论
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药材质量的影响因素有内因和外因，主要是植物基原和环境因素两方面。黄草乌作为云药伤科要药，同时又是剧毒类药材，种植基原的混乱可能会造成化学成分种类和含量的差异，进而影响药材质量的稳定性，用药安全隐患极大。目前有学者为了黄草乌的安全合理利用，对其化学成分（汪焕芹等，2014）、药理作用（温玉莹等，2019）和生药学鉴定（王丽等，2020）等方面展开了研究，尚未见有关黄草乌栽培品基原植物叶绿体基因组的报道。本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析方法对10个栽培品的全叶绿体基因组特征和系统发育关系展开了研究探讨，结果显示，10个栽培品的叶绿体基因组大小相似，均以典型的、高度保守的四分体结构存在，包括4个部分，1个LSC区、1个SSC区和1对IR区，叶绿体基因组长度差异仅为190 bp，GC含量均为38.1%，具有明显AT偏好性，均注释到131个基因，这与乌头属其他物种的叶绿体基因组研究结果十分相似（Liu et al.，2020; Zhang et al.，2021），说明叶绿体基因组进化速率较慢，在同属植物间表现出相对保守性。
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图2 10个栽培品全叶绿体基因组的简单重复序列分析
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Fig.2 Simple repeat sequences (SSR) analysis of complete chloroplast genome in 10 cultivated varieties
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叶绿体基因组中的SSR因其在数量方面没有生物学上的限制、多态性高、易复制且具有母系遗传模式等优点而被广泛应用于遗传多样性分析和分子标记辅助育种等方面的研究（Pauwels et al.，2012）。本研究通过在线分析工具在10个栽培品的叶绿体基因组中共发现60~73个SSR位点，其中单核苷酸SSR占比最大，其次为二核苷酸，拷贝数目增加，SSR数量逐渐减少，A/T为单核苷酸主要重复类型，AT/TA是二核苷酸主要重复类型，三核苷酸主要重复类型则是AAT/ATT，这与李雪佩等（2018）研究的云南省武定县的黄草乌叶绿体基因组中SSR类型一致，这些SSR位点可以为黄草乌的分子遗传学相关研究提供候选分子标记。虽然叶绿体基因组高度保守，但是基因结构和大小在10个栽培品叶绿体基因组的IR/SC边界也有一定不同，对10个栽培品进行全序列对比，发现他们的LSC、SSC和IR区域的大小存在细微差异，分别为86 496~86 680 bp、16 921~17 007 bp、26 127~26 170 bp，显示出适度的扩张，相对于LSC区和SSC区，IR区更为保守，这可能是由于IR区的重复基因会在突变发生时，通过基因转换对其进行修正，因此减弱了此区变异发生的频率（Chen et al.，2015），所有样品rps19、ndhF、ycf1和trnH基因的大小和分布在4个边界间的差异较小。基于mVISTA在线工具和DnaSP软件分析结果表明，10个样品存在一些变异率较高的区段，如trnK-UUU-trnQ-UUG、trnY-GUA-trnE-UUC、trnC-GCA-trnT-GGU、trnT-UGU-trnL-UAA、atpH-atpI、trnP-UGG-psaJ、rbcL-accD、ycf4-cemA、rpl16-rps3以及基因rpl20、ycf1、ndhF等，Park等（2017）和Meng等（2018）也有相似的研究结果。在以往的研究中，ndhF-trnL、psbA-trnH、psbD-trnT和trnT-trnL等片段被用于乌头属的系统发育研究（Hong et al.，2017），但乌头属种间亲缘关系未能得到很好的解决，今后这些变异热点区段，或许可以作为新的DNA条形码，用于黄草乌及乌头属植物的物种鉴定和系统发育关系等方面的研究。
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图3 10个栽培品叶绿体基因组LSC、SSC、IR边界比较
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Fig.3 Comparison of the junction between LSC，SSC and IR regions of chloroplast genome among the10 cultivated varieties
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与已有的条形码片段相比，全叶绿体基因组序列具有更高的分辨率，可以阐明较低阶元的系统进化关系（Nie et al.，2012）。本研究基于两种数据集采用不同的方法构建的系统进化树均表明，乌头属42条序列分为3个大的分支（乌头亚属、牛扁亚属和露蕊乌头亚属），乌头亚属与牛扁亚属构成姊妹类群，露蕊乌头亚属为乌头属的基部类群，10个栽培品均属于乌头亚属，但仅有JS-1-4、QJ-1-2、LX-1-3和LJ-3-2 4个栽培品与黄草乌亲缘关系较近，LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3和DC-2-2与滇南草乌亲缘关系较近，丽江的LJ-4-3在叶绿体全基因组序列构建的进化树中与兴安乌头系（Ser. Ambigua）的马耳山乌头亲缘关系更近，在蛋白质编码基因序列构建的进化树中则与蔓乌头系（Ser. Volubilia）的西南乌头关系较近；丽江另1个样品LJ-1-2在全叶绿体基因组序列构建的进化树中与保山乌头系（Ser. Bullatifolia）中的宾川乌头关系更近，在蛋白质编码基因序列构建的进化树中则与显柱乌头系（Ser.Stylosa）的苍山乌头关系近，这说明非编码区在植物系统进化中可能也起到了一定的作用。可见，除丽江地区的栽培品来源较为混乱外，其他地区的栽培种从亲缘关系上基本分为黄草乌和滇南草乌两大类，这说明目前各基地种植的黄草乌主要存在两种植物来源。此外，研究结果还显示蔓乌头系、兴安乌头系、显柱乌头系、保山乌头系等的部分类群交错在一起，这与中国植物志中乌头属系的划分并不一致，张富民等（2003）也得出了相似的结果，这提示依靠植物形态的经典分类系统可能存在一些问题。鉴于乌头属植物在生长过程中性状的多变性，仅依靠表型特征对其进行区别分类显然不够，这也可能是黄草乌在引种驯化的过程中出现种源混杂情况的原因。虽然目前乌头属大部分植物已经完成全叶绿体基因组测序，但有关该属植物的系统发育学研究还比较少，本研究推断的系统关系能够为乌头属植物的物种鉴定和系统进化等方面的研究提供重要信息。但是，乌头属植物种类繁多，仍然需要更多该属植物被加入系统发育的研究中且结合更多技术手段，才能得到更全面、更合乎实际的进化谱。
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图4 10个栽培品叶绿体基因组的可视化比对图
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Fig.4 Comparison diagram of chloroplast genome of 10 cultivated varieties
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图5 10个栽培品叶绿体基因组核苷酸多样性
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Fig.5 Nucleotide diversity of chloroplast genomes of 10 cultivated varieties
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图6 基于44个物种全叶绿体基因组序列构建的最大似然（ML）和贝叶斯（BI）系统进化树
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Fig.6 Phylogenetic tree of 44 species using maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) methods based on complete chloroplast genome sequences
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图7 基于44个物种蛋白质编码基因序列构建的最大似然（ML）和贝叶斯（BI）系统进化树
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Fig.7 Phylogenetic tree of 44 species using maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) methods based on protein-coding gene sequences
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综上所述，本研究从全叶绿体基因组的角度认为，目前云南省各大栽培基地所种植的黄草乌确实存在种源混杂的客观现象，主要有黄草乌和滇南草乌两种植物，但现行质量标准仅有黄草乌一种植物来源，因此对于黄草乌栽培药材的质量问题，首先应规范其种原，而对于滇南草乌能否也作为黄草乌药材来源收载，还需要通过研究他们化学成分和药理活性等方面的异同后再综合评判。
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摘要
为探究云南伤科用毒性药材黄草乌（Radix Aconitum Vilmoriniani）栽培品质量的影响因素，该研究利用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台对来自10个不同栽培基地黄草乌样品的叶绿体基因组展开测序，经过对测序数据的组装、注释，利用生物信息学工具对其叶绿体基因组特征展开分析并构建系统发育树。结果表明：（1）10个栽培品的叶绿体基因组全长155744~155937 bp，大单拷贝区和小单拷贝区分别为86363~86548 bp、16921~17007 bp，反向重复区大小为26170~26236 bp，均注释到131个基因。（2）序列鉴定出60~73个SSR位点，基因组比较分析发现，10个栽培品叶绿体基因组显示出一定的扩张，并在其中发现了trnK-UUU-trnQ-UUG等变异热点区域。（3）基于2个数据集的系统发育分析均表明，JS-1-4、QJ-1-2、LX-1-3、LJ-3-2与黄草乌（Aconitum vilmorinianum）亲缘关系较近；LQ-1-3、GJ-1-3、NL-1-3、DC-2-2和滇南草乌（A. austroyunnanense）关系较近；基于全叶绿体基因组序列构建的系统进化树中LJ-4-3与马耳山乌头（A. delavayi）亲缘关系近，LJ-1-2与宾川乌头（A. duclouxii）的亲缘关系较近；而基于蛋白质编码基因序列构建的系统进化树中，LJ-4-3与西南乌头（A. episcopale）亲缘关系近，LJ-1-2则与苍山乌头（A. contortum）关系较近。综上认为，黄草乌的栽培种植存在种源混杂的客观问题，主要有黄草乌和滇南草乌两种植物，个别栽培基地还掺混了乌头属（Aconitum）的其他物种，这可能是黄草乌栽培品质量不稳定的因素之一。
Abstract
To study the influencing factors on the quality of cultivated varieties of Radix Aconitum Vilmoriniani, a toxic medicinal material for traumatology in Yunnan Province, the chloroplast genomes of samples from 10 different cultivation bases were sequenced by Illumina HiSeq 4000 high-throughput sequencing platform. Then the sequencing data were assembled and annotated followed by analysis of the characteristics of the chloroplast genomes by bioinformatics tools and construction of the phylogenetic trees. The results were as follows: (1) The full length of chloroplast genome of the 10 cultivated varieties from different regions were 155744-155937 bp, the large single copy region (LSC) and small single copy region (SSC) were 86363-86548 bp and 16921-17007 bp, respectively, the size of the inverted repeat region (IR) was 26170-26236 bp. The GC content of chloroplast genome of 10 cultivated varieties was 38.1%, with obvious AT preference, and 131 genes were annotated, including 85 protein-coding genes, 37 tRNA genes and 8 rRNA genes. (2) These sequences identified 60-73 SSR sites, and genome comparative analysis found that the length of chloroplast genome of 10 cultivated varieties ranged from 155744 to 155937 bp with moderate expansion. Some variation hot spots were found, such as trnK-UUU-trnQ-UUG, trnY-GUA-trnE-UUC, trnC-GCA-trnT-GGU, ycf4-cemA, ycf1 and ndhF, etc. (3) Phylogenetic analysis based on the two datasets showed that JS-1-4, QJ-1-2, LX-1-3, LJ-3-2 were closely related to Aconitum vilmorinianum and LQ-1-3, GJ-1-3, NL-1-3, DC-2-2 were closely related to A. austroyunnanense. In the phylogenetic tree, which was constructed based on the complete chloroplast genomes, LJ-4-3 was closely related to A. delavayi and LJ-1-2 was closely related to A. duclouxii; while in the phylogenetic tree which was constructed based on the protein coding gene sequences (PCGs), LJ-4-3 was closely related to A. episcopale and LJ-1-2 was closely related to A. contortum. In summary, the hybrid origins of cultivation of Radix Aconitum Vilmoriniani include at least the two original plants: A. vilmorinianum and A. austroyunnanense, and other species of Aconitum even existed in individual cultivation bases. The mixed origins of cultivation may be one of the influencing factors on instability of the quality of Radix Aconitum Vilmoriniani.
