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广西壮族自治区桉树人工林种植面积超过133 333.33 hm2（唐健等，2021），居全国首位（姜仲翔等，2021），年产桉树木材2 100万平方千米以上（黎学文等，2020），其中桉树皮约为250万吨，桉木屑及边材约为300万吨（罗阳兰等，2023）。长期以来，仅有约3/4的桉树加工副产物用于制浆造纸原料、直接和间接燃料（刘曼红，2010），相当一部分直接填埋或焚烧（黄保成等，2023）。近年来，已有相关研究证明利用桉树皮（叶建强等，2021）或桉木屑（卢中强等，2021）等桉树加工副产物栽培的食用菌在食用菌生长适应性（王灿琴等，2018）、菌丝生长速度（袁滨等，2020）和菌包污染率降低（刘春丽等，2021）等方面均有一定的促进作用。
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肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）隶属于真菌门（Eumycota）担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus），是一类富含多种蛋白质、氨基酸和多糖的珍稀食用菌（段丹等，2021），具有抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等功能（戴照琪等，2022）。近年来，在福建、广东、广西等地栽培面积较大（高励勋等，2022），现有的代料栽培基质大多使用杂木屑（方志荣等，2021）、甘蔗渣和棉籽壳（王南南等，2022），但原料成本持续走高已成为限制产业发展的问题，寻求低廉的替代栽培基质成为研究热点（康超等，2016），Zhang等（2019a，b）用山核桃壳及油茶壳代替棉籽壳栽培，提高肺形侧耳的产量、生物学效率以及粗纤维、灰分、氨基酸等营养物质的含量。隆海玉等（2019）和刘明等（2016）利用草菇菌渣和金针菇菌渣栽培肺形侧耳，使其生物学效率分别达到20.3%和65.03%，提高了生产效益。目前，关于肺形侧耳的研究主要集中在栽培技术优化、优良菌种选育、品质分析检测、药理功能探究、采后贮藏保鲜和废菌渣再利用等方面（刘凌云等，2020），基于代谢组学技术对不同栽培基质在栽培过程中子实体代谢物和代谢途径的研究少有报道。
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目前，代谢组学在食用菌中应用尚处于起步阶段，李康乐（2012）利用HPLC-MS的代谢组方法对姬松茸、香菇、杏鲍菇、灰树花、平菇、金针菇等几种不同的食用菌及其他真菌的代谢组进行差异比较分析，发现不同菌类的特有化合物；刘芹等（2021）基于代谢组学研究了平菇栽培用培养料发酵过程中代谢物的差异和变化；杨建等（2023）基于UPLC-MS/MS分析了羊肚菌子实体酚酸类代谢物差异，这些研究为食用菌代谢组分分析提供了一定的参考价值。
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本研究基于UHPLC-MS/MS技术利用非靶向代谢组学对桉树加工主要副产物（桉木屑和桉树皮）与杂木屑等对照基质栽培的肺形侧耳的代谢产物进行分析，拟探讨以下科学问题：（1）桉树皮和桉木屑栽培基质和杂木屑栽培基质间差异显著的代谢产物有哪些；（2）分析差异显著的代谢通路有什么；（3）对比分析桉树皮和桉木屑栽培基质哪个基质更有利于栽培应用。以期在食用菌栽培应用方面提供参考。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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供试肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）菌株S1由广西农业科学院微生物研究所保存。
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棉籽壳（中国乌鲁木齐）购自中棉集团新疆农业有限公司；杂木屑（以枫木、椎木等木屑为主）、桉木屑和桉树皮（树种为尾叶桉）（中国南宁）均购自广西木立方木业有限公司；麦麸、桑枝屑、石灰粉、石膏粉、过磷酸钙（中国柳州）均购自广西融水县永富生态农业有限公司。
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1.2 仪器和试剂
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Vanquish超高压液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Q Exactive-HFX质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；5430R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；Wonbio-96c型多样品冷冻研磨仪（上海万柏生物科技有限公司）；LNG-T88型台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）；SBL-10DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BSM-220.4型分析天平（上海卓精电子科技有限公司）；NewClassic MF MS105DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。
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色谱纯的乙酸、甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸（Fisher，中国南宁）。
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1.3 培养基
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对照组为A组，B组和C组为处理组，A、B、C组出菇试验培养基配方分别添加50%的杂木屑、桉木屑和桉树皮，其余基料分别为桑枝屑20%、棉籽壳15%、麦麸12%、石灰2%、石膏0.5%、过磷酸钙0.5%，含水量65%。
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1.4 方法
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1.4.1 样本制备
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每组出菇试验培养基配方进行3个处理（每个处理5次重复），选用装袋的聚乙烯筒料袋规格为22.000 cm × 43.000 cm × 0.003 cm，每袋湿料（含水量为60%）分装2.5 kg并进行接种、发菌和出菇管理，后续试验处理取鲜子实体样进行。
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1.4.2 样品前处理
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将解冻后的样品称取50~100 mg，加入1 mL水∶乙腈∶异丙醇（1∶1∶1，V/V），涡旋60 s后低温超声30 min，12 000 g、4℃离心10 min取上清液，-20℃放置1 h沉淀蛋白，12 000 g、4℃离心10 min取上清液真空干燥复溶于200 μL 50%ACN中涡旋，14 000 g、4℃离心15 min后取上清液检测。
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1.4.3 UHPLC-MS检测
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色谱条件：整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，色谱柱为Waters HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流动相（A相为0.1%甲酸-水溶液，B相为0.1%甲酸-乙腈）。洗脱梯度：0.0~1.0 min A/B（100∶0，V/V），1.0~9.0 min A/B（5∶95， V/V），9~13 min A/B（5∶95， V/V），13.1~17.0 min A/B（100∶0，V/V）；流速0.3 mL·min-1；柱温40℃；进样量2 μL。采用随机顺序进行样本的连续分析同时检测样本队列中需插入 QC样品，以避免仪器检测信号波动的影响并监测系统的稳定性和数据的可靠性。
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质谱条件：采用美国Thermo公司Q Exactive HFX高分辨质谱系统进行一级、二级谱图的采集。电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）条件如下：离子喷雾电压3 000 V/-2 800 V；温度350℃；离子传输管温度320℃；鞘气40 arb；辅助气10 arb。扫描方式为正离子/负离子；扫描模式为Full-ms-ddMS2模式。一级扫描范围（scan m/z range）：70~1 050 Da，二级扫描 200~2 000，一级分辨率70 000，二级分辨率17 500。
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1.4.4 质控
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质控样品（quality control，QC）是一个由所有检测样品混合而成的样品，用于评估上机过程中分析系统的稳定性和实验结果的可靠性，QC样本与正式样本进行相同处理。
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1.4.5 数据处理
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用代谢组学处理软件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）对原始数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，数据库主要为HMBD和Metlin等公共数据库以及自建的数据库。数据预处理：（1）仅保留任一一组样品中非零值80%以上的变量；（2）总峰归一化，删除QC样本相对标准偏差（RSD）≥30%的变量；（3）将数据进行log10转化得到用于后续分析的数据矩阵。
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多维统计分析采用PCA主成分分析法及OPLS-DA分析法进行。通过变量投影重要度（Variable Important for the Projection，VIP）和T检验（T test）的P值来确定差异代谢物（其中VIP＞1，P＜0.05的代谢物为显著差异代谢物），同时Fold change≥1.0为上调代谢物，Fold change＜1.0为下调代谢物（Fold change为代谢物在两组间的差异倍数），通过 KEGG数据库和R语言分别进行的代谢通路注释和富集分析，并通过Fisher精确检验获得受到显著影响的代谢通路。
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2 结果与分析
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2.1 整体样本PCA分析
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PCA得分图在主成分PC1、PC2上的坐标点距离代表了不同样本间聚散程度，如图1显示QC聚合度高，说明QC重复性良好，分析系统稳定。
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2.2 OPLS-DA分析
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采用OPLS-DA分析法进一步提高模型解析能力及有效性，经7次循环交互验证得到OPLS-DA模型。各组样本OPLS-DA得分图（图2）表明各组都位于置信区间内。同时，由表1中R2X、R2Y和Q2参数值可知，各组Q2均大于0.5，表明该模型稳定可靠。
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通过随机改变分类变量Y的排列顺序进行置换检验以防止模型过拟合。由图3可知，在各组模型验证中，置换检验图左边所有Q2值都低于右边原始点，表明模型没有过拟合，可用于后续的差异成分分析。
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图1 PCA得分图
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Fig.1 PCA score plot
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2.3 样本中差异代谢物的确定
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由表2可知，与对照组A相比，处理组B共筛选出45种差异代谢产物，包括 13个氨基酸、12个有机酸、3个维生素、3个醛类、2个蛋白酶类、2个生物碱、2个胆碱类、2个核苷酸类、1个糖类、1个酮类、1个酯类、1个核苷类、1个有机酸酯、1个糖内酯，其中28种化合物上调。
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与对照组A相比，处理组C共筛选出53种差异代谢产物，包括18个有机酸、12个氨基酸、6个糖类、3个生物碱、3个维生素、2个磷脂类、2个糖苷类、1个糖内酯、1个醇类、1个核苷酸类、1个蛋白酶类、1个核苷类、1个酮类、1个醛类，其中30种化合物上调。
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处理组B和C相比，共筛选出39中差异代谢产物，包括9个有机酸、7个氨基酸、6个糖类、4个维生素、3个糖苷类、2个醛类、2个胆碱类、2个酯类、1个生物碱、1个蛋白酶类、1个糖内酯、1个醇类，其中21种化合物上调。
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综上结果表明，与对照组A相比，处理组B和处理组C子实体中糖类、氨基酸和有机酸等代谢物均显示上调，与处理组C相比，处理组B中氨基酸、糖类和有机酸等代谢物显著增加；各实验组代谢物差异的变化说明，栽培条件是影响食用菌风味和营养物质的重要因素之一，这些物质的增加有利于肺形侧耳营养物质的积累，对食用菌的生长有极大的促进作用，同时蛋白和糖类等营养物质含量水平的增加具有提高食用菌品质的潜力。因此，利用桉木屑栽培的肺形侧耳营养价值更高。
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图2 OPLS-DA得分图
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Fig.2 OPLS-DA score plots
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注： A-C 注同图1。 R2X （cum）、R2Y （cum）. 累积解释率; Q2 （cum）. 模型的预测能力; R2. 累积方差值; R2Y（cum）. 累积解释率; Q2. 累积交叉有效性。下同。
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Note： A-C as Fig.1. R2X （cum）、R2Y （cum）. Cumulative interpretation rates; Q2 （cum） Prediction ability of the model; R2. Cumulative variance value; R2Y（cum）. Cumulative interpretation rates; Q2. Cumulative cross validation. The same below.
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2.4 KEGG 通路注释与分析
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2.4.1 KEGG 通路注释结果
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KEGG通路注释结果表明共筛选到代谢通路115条，共分成12类，主要包括跨膜运输、氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、萜类化合物和聚酮的代谢、其他氨基酸的代谢、其他次生代谢物的生物合成、内分泌系统和DNA的翻译途径。其中，P＜0.05的通路共有28条（表3）。
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与对照组A相比，处理组B共筛选出8种差异代谢物通路（亚油酸代谢、赖氨酸降解、醚脂代谢、嘌呤代谢、玉米素生物合成、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢和屈烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成）。其中，影响极显著（P＜0.001）的是亚油酸代谢（检测到的差异代谢物为9-羟基亚油酸、9-羟基-10，12-十八碳二烯酸和13S-过氧化氢-9Z，11E十八碳二烯酸）。
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与对照组A相比，处理组C共筛选出15种差异代谢物通路（赖氨酸降解、亚油酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸代谢、氧化磷酸化作用、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、玉米素生物合成、丁酸代谢、组氨酸代谢、氨基酸生物合成和2-氧代羧酸代谢）。其中，影响极显著（P＜0.001）的是赖氨酸降解（检测到的差异代谢物为哌啶酸、肉碱、戊二酸、丁二酸和2-草酸）、亚油酸代谢（检测到的差异代谢物为9-羟基-10，12-十八碳二烯酸、13S-过氧化氢-9Z，11E十八碳二烯酸和9-羟基亚油酸）、ABC转运蛋白（检测到的差异代谢物为肉碱、L-鸟氨酸、甜菜碱、L-谷氨酸和蔗糖）和苯丙氨酸代谢（检测到的差异代谢物为2-羟基肉桂酸、D-苯丙氨酸、4-羟基肉桂酸和丁二酸）。
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图3 OPLS-DA置换检验图
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Fig.3 OPLS-DA permutation test plots
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处理组B和C相比共筛选出5种差异代谢通路（ABC转运蛋白、组氨酸代谢、醚脂代谢、甘油磷脂代谢和赖氨酸降解）。其中，影响极显著（P＜0.001）的是ABC转运蛋白（检测到的差异代谢物为蔗糖、L-谷氨酸、甜菜碱和肉碱）。
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2.4.2 KEGG 通路富集分析
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KEGG通路富集分析中P＜0.05且重要性值大于0.10的代谢通路为显著性代谢通路。处理组B和对照组A实验中无显著性代谢通路（P＞0.05）（图4：a）。处理组C和对照组A实验中显著性较强的代谢通路共有4条（图4：b）：（1）精氨酸生物合成，包括L-鸟氨酸和L-谷氨酸；（2）精氨酸和脯氨酸代谢，包括D-脯氨酸、L-鸟氨酸和L-谷氨酸；（3）泛酸和辅酶A生物合成，包括脱磷酸辅酶和泛酸；（4）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，包括L-谷氨酸和丁二酸。处理组B和C中显著性较强的代谢通路共有1条（图4：c），为组氨酸代谢，参与差异代谢物为麦角硫因和L-谷氨酸。
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3 讨论与结论
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代谢物作为生物体表型基础能有效地明确生物学过程及其机理（霍冬敖等，2021）。本研究基于UHPLC-MS/MS技术采用非靶向代谢组学，研究桉树加工副产物（桉木屑和桉树皮）与杂木屑等对照基质栽培的肺形侧耳的代谢产物差异。通过代谢组学分析出包括氨基酸、有机酸、糖类、维生素类、生物碱等在内的137种差异表达代谢物，本研究发现两个处理组（桉木屑和桉树皮）中氨基酸、糖类和有机酸等代谢物均显示上调，表明这两种栽培基质可以提高肺形侧耳中多糖、蛋白质等营养物质含量水平，具有提高其品质的潜力（林辉等，2022）。然而，对桉木屑处理组和桉树皮处理组中代谢物分析发现，利用桉木屑的使用可促进肺形侧耳代谢物中氨基酸、糖类和有机酸等物质增加，与课题组前期的营养成分研究中，桉木屑肺形侧耳的粗蛋白、可溶性糖和粗灰分的含量高于桉树皮肺形侧耳，而粗脂肪含量较低的结果相佐证。孙瑞祥（2022）研究发现金针菇生长发育过程中，不同碳氮比栽培配方间氨基酸代谢、次生代谢产物生物合成、脂肪酸代谢、嘌呤与嘧啶的合成、柠檬酸循环、细胞周期等途径有差异，不同碳氮比配方对金针菇生长发育和子实体营养品质产生显著影响。陈丽新等（2015）在对比桉树皮、桉木屑栽培平菇营养成分的研究中也发现桉木屑提高平菇营养成分含量的效果更佳。这表明肺形侧耳差异代谢物种类和表达与培养料成分差异密切相关，可能与微生物分解后释放出可利用营养物质的质与量的差异有关。
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续表2
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续表2
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续表2
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注： A-C 注同图1，下同；↑、↓分别表示该物质含量的显著性上升和下降。
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Note: A-C as Fig.1, the same below; ↑, ↓ represent the significant increase or decrease of the content of the substance respectively.
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在桉树皮和桉木屑栽培的肺形侧耳子实体中显著上调且差异倍数较大的物质，如羟基肉桂酸类化合物、对羟基苯甲醛、甘油磷酰胆碱、甘油磷酸胆碱、甜菜碱和氨基己酸等化合物均具有显著的生物活性：羟基肉桂酸类化合物是的一类酚酸类化合物，在阿尔茨海默病治疗中的作用日益凸显（徐李亮等，2022）；对羟基苯甲醛通过促进相关信号通路来改善大鼠肝脏氧化应激、炎性反应，减少脂质合成，从而改善克罗恩病（许晓飞等，2022）和非酒精性脂肪肝（刘梦等，2022）；甘油磷酰胆碱具有治疗老年痴呆、脑部中风、促进青少年身体成长、提高记忆力等方面的功效（卢志花和江磊，2018）；甘油磷酸胆碱具有降低高血脂、改善老年人的记忆和认知能力、治疗阿尔茨海默病和修复脑神经损伤病等功效（鹿保鑫和张文喆，2015）；甜菜碱具有维持细胞渗透压、转甲基、调节脂肪代谢等生物功能，其作为饲料添加剂可调节动物蛋白质合成和脂肪代谢，增强机体免疫力与抗氧化能力（李顺泽等，2022）；氨基己酸在临床上已广泛应用于骨科、胸外、脑外等手术术中和术后出血的防控和纤溶亢进性疾病（罗序睿和黄亮，2022）。这些活性显著的化合物的显著上调表明，利用桉树加工副产物代替杂木屑等基质栽培肺形侧耳可显著提高其营养成分和活性物质的含量及其食用价值。
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食用菌风味包括香味（依赖于挥发性风味成分）与滋味（取决于非挥发性呈味物质的种类及含量）（李晶等，2021），如呈味氨基酸、风味核苷酸、有机酸、呈味肽以及其他类呈味物质。KEGG富集分析发现差异显著的代谢通路主要涉及精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，其主要与辅助因子和维生素的代谢、氨基酸代谢等生理作用相关。代谢通路分析可知，不同栽培基质对肺形侧耳中氨基酸、维生素等辅助因子的合成代谢影响较大，桉树皮和桉木屑栽培的肺形侧耳中谷氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等呈味氨基酸上调，说明利用桉树加工副产物（桉树皮和桉木屑）作为肺形侧耳的主要栽培基质可显著改善其子实体风味，并为肺形侧耳种植、品质评价等提供一定的科学依据。
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此外课题组研究发现以桉木屑为主料栽培肺形侧耳，投产比可达1.00∶1.96（王灿琴等，2016），综合多方面因素可知，桉树皮和桉木屑（尤其是桉木屑）作为肺形侧耳的主要栽培基质可实现资源再利用且同时降本增效，并促进桉树产业和食用菌产业共同健康、快速、可持续发展。
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图4 KEGG 富集通路图
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Fig.4 KEGG enrichment pathway diagrams
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摘要
桉树因其优异的特性在我国拥有广大的种植面积，在其栽培和生产加工过程会产生大量的桉树皮和桉木屑等副产物，其剩余物资源较丰富。目前已有利用桉木屑栽培食用菌的报道，为了解桉树皮和桉木屑与杂木屑栽培的肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）代谢物的差异，该研究采用超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）技术，结合正交偏最小二乘法-判别分析法(Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis，OPLS-DA)对不同栽培基质条件下肺形侧耳子实体的代谢物进行了非靶向代谢组学研究。以变量权重值（Value Importance in Projection，VIP）＞1结合T检验P＜0.05为标准进行筛选。结果表明：（1）处理组B（桉木屑）与对照组A（杂木屑）之间有45种差异代谢产物和8种差异代谢物通路，处理组C（桉树皮）与对照组A之间有53种差异代谢产物和15种差异代谢物通路，处理组B与处理组C之间有39种差异代谢产物和5种差异代谢物通路。（2）根据KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）代谢通路富集分析处理组C和对照组A得到4条显著的代谢通路，分别为精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，处理组B和处理组C得到1条显著的代谢通路为组氨酸代谢，而处理组B和对照组A中无显著性代谢通路（P＞0.05）。综上表明，利用桉树皮和桉木屑作为肺形侧耳的主要栽培基质（尤其是桉木屑），可以降本增效和实现资源再利用。该研究结果为桉树加工副产物应用于食用菌栽培提供了参考。
Abstract
Due to excellent characteristics, there is a vast planting area of eucalyptus in China. Its cultivation, production and processing processes will produce a large number of eucalyptus bark and sawdust, of which surplus resources are rich. It has been reported to cultivate edible fungi using eucalyptus sawdust. To analyze the difference of metabolites and their pathways in Pleurotus pulmonarius cultivated with three different substrates among eucalyptus bark, eucalyptus sawdust and miscellaneous sawdust. Based on the Ultra-High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS) technique, an untargeted metabolomic study was performed on the differences metabolites of fruit bodies of Pleurotus pulmonarius under different cultivation substrates by and Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis (OPLS-DA). The results were as follows: （1） The screening results based on Value Importance in Projection (VIP)＞1 and T test P＜0.05 showed that there were 45 differential metabolites and eight differential metabolite pathways between treatment Group B (eucalyptus sawdust) and control Group A (miscellaneous sawdust), 53 differential metabolites and 15 differential metabolite pathways between treatment Group C (eucalyptus sawdust) and control Group A, and 39 differential metabolites and five differential metabolite pathways between treatments Group B and Group C, respectively. （2） According to the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment metabolic pathway, four significant metabolic pathways were obtained between treatment Group C and control Group A, including arginine biosynthesis, arginine and proline metabolism, pantothenate and CoA biosynthesis, alanine, aspartate and glutamate metabolism, and treatment groups B and C obtained one significant metabolic pathway which was Histidine metabolism, while there was no significant metabolic pathway between treatment Group B and control Group A (P＞0.05). In conclusion, using the by-products of eucalyptus processing (eucalyptus bark and eucalyptus sawdust) as the main cultivation substrates of P. pulmonarius, especially eucalyptus sawdust, can realize resource recycling, reduce production costs and improve economic benefits. This study provides a theoretical basis for the application of eucalyptus processing by-products in the cultivation of edible fungi.