花药是雄蕊的重要组成部分，含有与花粉粒形成及释放有关的生殖和营养组织。成熟的花药适时开裂，才能释放花粉，从而保证传粉与受精过程的顺利进行（丁泽琴等，2013）。被子植物中花药的开裂方式有4种，即纵裂、横裂、孔裂和瓣裂。花药纵裂是最普遍的花药开裂方式，其过程和机制已非常清楚。绝大部分植物的花药为纵裂（Endress，1996）；横裂见于部分锦葵科植物（马炜梁，2015），横裂实际上与纵裂相似，仅开裂方向因与花药的纵轴垂直而不同，有学者不把横裂作为一种单独的类型（Endress，1996）；孔裂见于杜鹃花科（Hermann &Palser，2018）、野牡丹科（Renner，1989; Cortez et al.，2014）、部分茄科（Garcia et al.，2008）和部分豆科（Marazzi et al.，2007）植物中；瓣裂出现在小檗科（Batygina，2002）、金缕梅科（Huford &Endress，1989）和木兰类（Huford &Endress，1989）的一些类群中。

花药孔裂出现于少数类群，因此关于这方面的研究较少。García等（2008）和Cortez等（2014）分别对茄科茄属（Solanum）和野牡丹科绢木属（Miconia）的花药孔裂研究表明，两个科中花药顶孔或裂口部位的花药壁都只有一层细胞，这层细胞分解或断裂后形成了顶孔，而顶孔周围的花药壁由多层细胞构成，具有表皮和药室内壁。Hermann和Palser（2018）对杜鹃花科多个种属的成熟花药结构研究发现，这些种类花药的顶孔部位均无表皮和药室内壁，而有两种薄壁组织，即回吸组织（resorption tissue）和塌陷组织（collapse tissue）。这在一定程度上揭示了孔裂型花药散粉孔的解剖结构和组织构成，但这些研究主要集中观察顶孔开裂前和开裂时的结构，没有揭示完整的散粉孔发育过程。散粉孔处的解剖结构和周围花药壁的结构有何不同，它们的解剖结构差别源于何时，是否来源于相同的组织，发育的过程如何，散粉孔形成后如何散粉等都没有完整解答。散粉孔的形成是整个雄蕊发育过程的一部分，尤其与花药壁的发育密切相关，只有对雄蕊发育的全过程进行研究才能完整揭示顶孔的发育过程。

杜鹃花科是花药孔裂的一个代表科，有的是典型的顶孔开裂，有的散粉孔在侧面，还有一些是形成裂缝（Hermann &Palser，2018）。该科种类较多，约有125属4 000种（Fang et al.，2005），其中种类最多的是杜鹃花属（Rhododendron），全世界共约1 000种，我国571种（Fang et al.，2005），其中大多数是特有种（马宏等，2017）。杜鹃花属具有典型的顶孔开裂型花药，此前关于杜鹃花属雄蕊发育的研究很少，仅在Hermann和Palser（2000，2018）的研究中涉及一两种且无详细过程。张玉红（2014）和戴利燕（2018）研究了杜鹃属中另一个常见种映山红（Rh. simsii）的雄蕊发育过程，但未涉及顶孔的发育。锦绣杜鹃（Rhododendron × pulchrum）是杜鹃属中广为栽培的种类，花多量大，由于取材及各时期的雄蕊均易获得，因此对其进行雄蕊发育的形态学观察和解剖学研究，以探究散粉孔的形成过程和散粉机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为锦绣杜鹃（Rhododendron × pulchrum），采自云南大学呈贡校区。

1.2 实验方法

1.2.1 锦绣杜鹃雄蕊发育外部形态观察

取锦绣杜鹃的花蕾、幼花直至顶孔开裂的雄蕊，在尼康体视显微镜下用解剖针小心剥去花的苞片、萼片和花瓣，留下花芽顶端和雄蕊，并观察拍照。

1.2.2 锦绣杜鹃雄蕊发育组织形态观察

用普通石蜡切片法对不同发育时期的花蕾及单独的雄蕊进行切片观察。于2022年2—6月采集不同发育时期锦绣杜鹃的花蕾和花朵，固定于FAA固定液（ 50%酒精∶冰醋酸∶甲醛 = 90∶5∶5）中，系列酒精浓度脱水，常规石蜡切片法制片，切片厚度为8 μm，番红固绿染色，中性树胶封片，参考植物组织制片学的方法（李正理，1987）。在Olympus B51显微镜下进行镜检和照相。花药的发育类型判断按照被子植物生殖生物学标准（胡适宜，2005）。

一般雄蕊发育的研究只进行横切观察，因我们要观察其顶端散粉孔的形成，所以对雄蕊同时进行横切和纵切实验，并且纵切还采用多个方向的切面，以全面观察散粉孔的发生和发育过程。

2 结果与分析

2.1 锦绣杜鹃雄蕊发育的外部形态

锦绣杜鹃雄蕊从发生到成熟的整个发育过程形态变化如图1所示。当花瓣原基发育为半圆形时，雄蕊原基开始发生（图1：A）。雄蕊原基的发生为2/5式，首先有5个原基按顺时针或逆时针方向发生，形成一圈（图1：A），然后在之前发生的5个原基的间隙再发生一轮，最后10个雄蕊原基共同形成一圈（图1：B，C）。雄蕊原基发生有先后，第二轮原基发生时，第一轮中最早的已分化出花丝和花药（图1：B）。雄蕊原基发生时为小而扁的突起（图1：A），稍大即分化出上部膨大的花药和下部较细的花丝（图1：B），此时花药为基着药，花药与花丝连接为钩状，花药横向生长（图1：B）。此后，花丝向上生长，花药转而向下生长且迅速增大，花药由最初的基着药（图1：B）变为背着药（图1：C-E），着药点位于近顶部（图1：C-E）。随着细胞分裂，花药向下向外生长，花粉囊逐渐膨大饱满，花丝被埋于两侧花粉囊之中（图1：F-I）；花粉囊颜色逐渐加深，最初为近透明（图1：B-D），之后变为白色（1：E，F），再变为粉色（图1：G-I），成熟时花粉囊为紫色（图1：J-L）。早期构成花药的左右两侧如圆棒状，发育过程中同侧的2个花粉囊都发育增大，各自产生1个纵沟（图1：H-L），雄蕊最终在外形上呈现4个可明显分辨的花粉囊。

成孔区在雄蕊上的出现很早，雄蕊原基刚分化出花药时顶端就出现2个凹陷，即将来的成孔区（图1：B），此后自始至终存在于花药顶端。起初因整个花药无色，成孔区（dz）仅表现为凹陷（图1：D-F），随着花粉囊颜色加深，成孔区越来越明显，可以明显看出成孔区与周围花药壁有不同的组织构成（图1：G-I）。花药成熟时整个花药无纵裂口，仅顶部成孔区组织分解，成为散粉孔（dp）（图1：J，K）；由于白色花粉（p）从散粉孔向外“吐出”（图1：L），并且花粉间有很细的粘丝使花粉相连，因此花粉成团粘在散粉孔周围（图1：L）。

2.2 锦绣杜鹃花药发育的解剖学研究

2.2.1 横切面上花药壁与花粉的发育

从横切面来看，锦绣杜鹃的花药为四室花药。发育初期在4个角隅处表皮下分化出孢原细胞，孢原细胞比周围细胞体积稍大，细胞质浓厚（图2：A）。孢原细胞进行一次平周分裂产生2层细胞，即初生周缘细胞和初生造孢细胞（图2：B）。初生周缘细胞再次分裂产生次生周缘细胞（图2：B），再经过数次平周分裂和垂周分裂形成多层花药壁；初生造孢细胞经过多次分裂形成次生造孢细胞（图2：C），次生造孢细胞胞质浓厚，紧密排列，形状为三角形或四角形等不规则形（图2：C）。花药壁在次生造孢细胞时期分化出4层细胞，即一层表皮、一层药室内壁、一层中层和一层绒毡层（图2：C）。其中，表皮细胞体积较大，细胞壁较厚，有大液泡，其余几层细胞体积都很小，胞质较浓（图2：C）。

造孢细胞继续发育成为小孢子母细胞。锦绣杜鹃的小孢子母细胞在药室内并不分散开，依然紧密排列，但在细胞外生成厚的胼胝质使小孢子母细胞相互隔离（图2：D，F）。小孢子母细胞进行减数分裂成为小孢子二分体和四分体（图2：D），此过程发生很快，一个药室内同时具有小孢子母细胞、二分体和四分体（图2：D，F），全部紧密排列在药室内。花药壁在造孢细胞时期并未发育完全，药室内壁和中层在小孢子减数分裂期间仍继续分裂，直至四分体前花药壁才分化完全，有6~7层细胞，从外到内依次是1层表皮、2~3层药室内壁、2层中层和1层绒毡层（图2：D，E）。表皮细胞较大，细胞壁较厚；药室内壁细胞比表皮细胞小；中层细胞最小且扁平（图2： E）；绒毡层细胞大且胞质浓厚，与造孢细胞紧密连接但与中层分离（图2：D，E）。因此，绒毡层可能与造孢细胞同源，但不来自周缘细胞。

四分体形成后，四分体外部的胼胝质壁分解变薄，四分体与四分体之间相互分散（图2：G），但四分体内的4个小孢子并不从中释放出来，而是以四分体的形式共同发育，成为四合花粉。小孢子相邻的细胞壁紧密结合在一起形成花粉壁，构成复合花粉的基础（图2：G），每个小孢子从绒毡层吸收营养迅速增大成为单核花粉，之后再进行核分裂成为二细胞的花粉，成熟花粉外壁具有颗粒状的纹饰，从而使整个小孢子四分体最终发育为四合花粉（图2：J）。

在四分体发育为四合花粉的过程中，花药壁发生复杂的变化。中层在小孢子减数分裂期间有2层细胞，由于四分体完成后迅速分解，到四分体分散开时中层就已消失，因此中层存在时间非常短暂。中层分解后绒毡层开始分解，绒毡层为腺质绒毡层，在原位分解，为四分体内的小孢子发育提供营养，小孢子迅速长大成为单核花粉，之后再核分裂为二核花粉（图2：G）。此时绒毡层向外推移，将药室内壁挤压为扁平状，紧贴表皮（图2：G）。花粉发育完成时，绒毡层的营养尚未完全消耗，此时绒毡层紧贴药室内壁，为药室内壁提供营养使其重新发育，细胞内积累多糖颗粒（图2：H，I）。最终花药壁在散粉前由一层表皮和2~3层药室内壁构成，药室内壁细胞因积累多糖而加厚，具有韧性和弹性（图2：H，I）。

锦绣杜鹃有4个药室，在横切面上呈蝶形（图2：A），左右各2个药室（即花粉囊）。横切面上同侧2个药室之间最初由薄壁组织分隔（图2：A），药室发育后，中层和绒毡层构成药室之间的分隔部分（图2：K）。中层和绒毡层先后分解（图2：K），薄壁组织也完全分解，最终同侧的2个药室在散粉前完全贯通成为一体（图2：L）。接近顶部的花药横切面结构与整个花药不同，顶端没有正常的花药壁，仅由薄壁组织构成（图3：H），这部分为成孔区，组织分解后成为散粉孔。

2.2.2 纵切面上花药壁的发育

从纵切面来看，雄蕊原基首先分化出下部的花丝（图3：A），然后上部顶端分生组织进行分裂，外侧分裂较快，最后使原基顶端向内弯曲（图3：A）。此时顶端分生组织细胞仍在分裂，顶端稍下的部分先分化出表皮，表皮内又有四团分生组织，其中有孢原细胞（图2：B）。孢原细胞再进行细胞分裂，经多次分裂分化形成花药壁和造孢细胞（图3：C，D）；顶端分生组织则分裂形成薄壁组织（图3：C，D）。由于孢原细胞位于顶端分生组织以下且生长方向向下，故薄壁组织始终位于花药顶端（图3：C，D）。花药分为左右2个部分，各自向下向外生长；由于中部花丝的生长，最初的分生组织被分隔成左右2个薄壁组织区（即将来的成孔区），位于左右花药的上端（图3： C，D，F-H）。起初花药很小，顶端的薄壁组织位置高于花药（图3：C，D），由于顶端薄壁组织先停止分裂，而花药持续发育，因此顶端薄壁组织所占比例越来越小，低于周围的花药壁，形成凹陷，即成孔区（图3：F-H）。花粉成熟时，花药壁的中层和绒毡层分解消失，表皮和药室内壁仍然存在（图3：I）；由于顶端成孔区仅有薄壁组织而没有花药壁，故薄壁组织分解后成为散粉孔（图3：I）。

花药发育的早期、中期在横切面上具有4个药室，但最终只有2个散粉孔，这是因为花药的4个药室中，左右两侧每一侧的2个药室是以薄壁组织构成的室间隔相分离，二室的顶端为共同的薄壁组织构成的成孔区（图3：G）。横切面上的花药结构除顶孔部位（图3：H）之外都是相同的，但纵切面上因所切角度不同而有3种情况：一种是不通过花丝和室间隔，能观察到左右完全2个分离的花粉囊（图3：E）；一种是通过花丝以及两侧花药的室间隔，显示的大部分是薄壁组织构成的室间隔（图3：F）；还有一种是只切到一侧花粉囊，显示的是同侧2个花粉囊被室间隔分隔，但上部有共同的薄壁组织区（图3：G）。起初室间隔的薄壁组织细胞较多，后来逐渐分解（图3：G），两室贯通成为一室，上端成孔区的薄壁组织分解后形成1个散粉孔（ 图3：I）。此外，从近顶端的横切也可清楚看到顶端每侧花药具有一个薄壁组织区（图3：H）。

3 讨论与结论

3.1 锦绣杜鹃花药发育的特征

前人对杜鹃花科的雄蕊发育进行研究，发现它们具有的共同特征主要有腺质绒毡层、药室内壁无纤维化和带状加厚以及四合花粉（Matthews &Knox，1926; Bowers，1930; Copeland，1943; Davis，1966; Hermann &Palser，2000; 高连明等，2002），其中杜鹃花亚科（Rhododendroideae）有一个区别于其他亚科的特征是花粉间具有粘丝（Matthews &Knox，1926; Bowers，1930; Copeland，1943; Waha，1984; Hesse，1986; Clemants，1995）。不同类群间的差异主要在花药壁的构成上，报道的花药壁层数从2层到4层（Chou，1952; Batygina et al.，1963; Budell，1964; Yakobson，1968; Hermann &Palser，2000），尤其是药室内壁的差异较大，有的甚至认为某些种类没有分化完全的药室内壁（Chou，1952; Davis，1966）。

本研究观察到的一些结果与前人对杜鹃花科的研究结果相同，如腺质绒毡层、花药内壁无纤维化和带状加厚、具有四合花粉以及花粉间具有粘丝等，但花药壁的发育尤其是药室内壁的发育却与前人的研究结果不尽相同。本研究发现锦绣杜鹃的药室内壁在各阶段持续发育和变化，不同时期观察到的药室内壁层数和形态不同，至少可以观察到4种不同的情况：一是造孢细胞时期药室内壁仅有1层且细胞较小；二是在小孢子减数分裂期间具有2~3层药室内壁细胞，此时药室内壁之外还有2层中层；三是花粉发育期间绒毡层向外推移，药室内壁被挤压成扁平状，此时中层已分解消失，药室内壁紧贴绒毡层；四是散粉前药室内壁细胞内积累多糖颗粒，使药室内壁重新加厚。前人对杜鹃花科报道的花药壁层数从2层到4层不等（Chou，1952; Batygina et al.，1963；Budell，1964；Yakobson，1968; Hermann &Palser，2000），有的报道甚至认为没有发育完全的药室内壁，这种差异可能是种属间的系统差异，也有可能是没有观察到药室内壁的各种情况，有的作者提到自己可能没有观察到全部情况（Chou，1952）。张玉红（2014）和戴利燕（2018）在对杜鹃属另一常见种杜鹃（映山红）雄蕊发育的研究中，也观察到药室内壁在花药成熟时积累多糖，至少这一点是一个稳定的特征。

关于绒毡层的来源，有的研究认为杜鹃花科的绒毡层来源于周缘细胞，而Davis（1966）则认为绒毡层与造孢细胞同源；本研究中锦绣杜鹃早期绒毡层与造孢细胞紧密结合，但与花药壁的其他几层细胞分离，推断其与造孢细胞同源；张玉红（2014）对杜鹃的研究也认为绒毡层与造孢细胞同源。由于后期绒毡层又向外推移与药室内壁紧贴，为药室内壁提供营养，所以如果仅观察到后期则会认为绒毡层来源于周缘细胞。

此外，前人研究发现杜鹃花科许多种的雄蕊在早期发育时有生长方向的倒转，花药从发生时的基着药转变为后来的背着药（Artopoeus，1903；Matthews &Knox，1926；Hermann &Palser，2000）。本研究从形态也观察到了这一现象，纵切结果显示这是由孢原组织发生于分生组织的下方且向下生长所致。

3.2 散粉孔的发生、发育过程和散粉机制

通过对锦绣杜鹃各个时期花药的形态观察和横向与纵向的石蜡切片，可以得出其顶端散粉孔的形成过程：花药顶端的成孔区由薄壁组织构成，薄壁细胞分解成为散粉孔，薄壁组织来源于雄蕊原基早期的顶端分生组织；而花药的主体部分则由孢原细胞发育而来，孢原发生于分生组织下方且发生后向下生长，经多次分裂分化后发育为花粉囊，花粉完全成熟时花药壁保留表皮和2~3层药室内壁。也就是说，形成散粉孔的成孔区与花药其余部分在雄蕊发育的早期即已发生分异。此前也有学者认为杜鹃花科的散粉孔来源于分生组织（Artopoeus，1903；Hermann &Palser，2018），本研究再次证实了这一推测。

在普通纵裂型花药中，花药纵裂一般涉及3个不同的组织和过程，即绒毡层分解、药室内壁纤维化和裂口形成。花药发育过程中中层和绒毡层先后分解消失，药室内壁的内切向壁和横向壁纤维加厚，但在2个花粉囊之间的交界处有几个不加厚的细胞，称为“唇细胞”（横切面上几个，纵向成列），花药成熟时由此开裂形成裂缝（周云龙和刘全儒，2004；丁泽琴等，2013）。简而言之，唇细胞是在花药发育的后期与其他药室内壁细胞产生差别，而早期是与药室内壁细胞同源的一类细胞。可见，锦绣杜鹃的孔裂和普通纵裂的发生机制有很大的差别，不仅有发生部位的差别，而且有发生时期和组织细胞的差别。

在此前学者对杜鹃花科花药孔裂机制的研究中，一般认为与两种组织有关，一种叫做回吸组织，另一种叫做塌陷组织或萎缩组织（Artopoeus 1903；Maclachlan，1929; D’Arcy et al.，1996; Hammer &Palser，2018）。这两种都是薄壁组织，前者的细胞可以吸收草酸钙等无机盐形成晶体，形成大的囊袋，细胞破裂后释放晶体形成散粉孔，而萎缩组织不吸收无机盐，仅细胞缩小萎缩形成散粉孔。本研究中，锦绣杜鹃花药成孔区的细胞既没有积累晶体形成囊袋也没有发生萎缩塌陷，而是分解消失，我们将其称为更广义的薄壁组织。

纵裂的花药只要花药壁裂开，花粉就可自然散出，而顶孔开裂的花药，其散粉孔位于顶端，若无特殊机制花粉难以从顶孔散出。本研究发现锦绣杜鹃花药壁的一些发育特征适应顶孔开裂。第一，锦绣杜鹃的花药壁有2~3层药室内壁，成熟时并不发生纤维化，反而在花粉成熟前积累多糖而加厚，这使花药壁保持完整并增加了厚度、韧性和弹性。第二，锦绣杜鹃的花粉为四合花粉且花粉间具有粘丝，推测多层药室内壁使花药壁增厚，积累多糖后进一步加厚且具有一定弹性，使得花粉囊内部空间缩小，从而将上部的花粉从顶孔“挤出”，这与我们在解剖镜下看到花粉从散粉孔“吐出”一致；而四合花粉间的粘丝使花粉粘连成团，在蜜蜂传粉时可以被成团带出，弥补了散粉孔位于顶端造成的散粉困难。第三，绒毡层早期为小孢子发育提供营养，后期外移，为药室内壁提供营养，使药室内壁再次发育增厚，这也是其适应顶孔散粉的一个发育特征。

总之，本研究表明锦绣杜鹃的散粉孔来源于顶端特殊的成孔区，成孔区由薄壁组织构成，分解后成为散粉孔；锦绣杜鹃的花药壁有多层药室内壁，药室内壁细胞于花粉成熟前因积累多糖而使花药壁加厚，具有四合花粉且花粉间具粘丝等都是与孔裂相适应的特征，能促进花粉从顶孔散出。

参考文献