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COBRA基因最早发现于拟南芥根细胞中（Borner et al.，2003），是一类广泛存在于高等植物和藻类植物（任昂彦等，2021）中的纤维素合成酶基因（Kasirajan et al.，2018），其编码的蛋白属于糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI），包含N端信号肽、碳水化合物结合域、富含半胱氨酸的CCVS结构域和C末端GPI蛋白的ω-位点（Roudier et al.，2002）。目前，已鉴定了棉花、大白菜、茶树、番茄、玉米等多种植物的COBRA基因。有研究表明COBRA可通过调节纤维素微纤丝的合成及沉积，在初生和次生细胞壁纤维素的生物合成中发挥核心作用（Li et al.，2019； 任昂彦等，2021），并广泛参与根、茎、叶、花及果实的发育，影响植物的生物量（元志成等，2020； Zaheer et al.，2022; Li et al.，2022），如棉花GhCOBL9A的过量表达可使生物量增加（Niu et al.，2018），茶树CsCOBRA基因可通过调控叶片细胞壁及机械强度，从而影响茶叶的产量（艾安涛等，2021）。
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蛇足石杉（Huperzia serrata）是中药材千层塔的来源之一，具有活血行瘀、止血生肌、消肿定痛、清热解毒、退热除湿等功效，用于治疗跌打损伤、劳伤吐血、痔疮便血、肺痈、烧烫伤等（黄玉妹等，2023）。其主要成分石杉碱甲对阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）具有良好的疗效且外周不良反应轻微（姬生国，2007）。预计到2050年，全球AD患病人数将达1.39亿（Jia et al.，2018），我国老年人患病人数将达3 003万（王英全等，2019），蛇足石杉需求量不断增大，市场前景良好。近年来，蛇足石杉的人工栽培取得了一定进展，但因其生长缓慢，繁殖困难，至今尚未实现大规模栽培，产量远远不能满足市场需求。高产量、高效益的蛇足石杉现代化生产已成迫切需要，通过COBRA等纤维素合成酶基因的调控有望成为蛇足石杉生物产量增长的新途径。
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本研究以蛇足石杉为研究材料，从其全长转录组测序数据中筛选COBRA基因，通过生物信息学技术对基因特征及在组织中的表达量进行分析，探讨以下问题：（1）蛇足石杉COBRA基因家族的生物信息学特征；（2）COBRA基因在蛇足石杉生长发育中可能发挥的作用。旨在为将来蛇足石杉COBRA基因功能的鉴定和调控奠定基础，以及为蛇足石杉的分子育种提高产量提供依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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蛇足石杉植株于2019年8月在广西南宁市大明山采集，经广西药用植物园冯世鑫高级工程师鉴定为石杉科植物蛇足石杉（Huperzia serrata）的全草。蛇足石杉全长转录组数据由深圳华大基因股份有限公司PacBio Sequel平台提供。
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1.2 方法
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1.2.1 蛇足石杉COBRA基因家族成员鉴定
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基于蛇足石杉的全长转录组测序数据及其注释结果，利用拟南芥COBRA基因家族成员的DNA序列作为种子序列，BLAST比对搜索蛇足石杉全基因序列数据库，筛选阈值E≤10-5，获得蛇足石杉的COBRA基因家族成员。
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1.2.2 蛇足石杉COBRA基因家族的理化性质、信号肽、亚细胞定位和结构域分析
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将蛇足石杉COBRA基因家族的原始碱基序列通过开放阅读框ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）获得潜在的蛋白质编码片段。利用ExPAsy（Expasy-ProtParam tool）对COBRA基因编码的蛋白质序列进行理化性质预测；用SignalP-6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）进行信号肽预测；用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行亚细胞定位预测；用Batch CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行结构域预测，并利用TBtools 1.112软件进行可视化处理。
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1.2.3 蛇足石杉COBRA基因家族的二级结构、三级结构和顺式作用元件分析
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分别通过Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）进行二级结构和三级结构预测。以蛇足石杉COBRA基因家族上游2 000 bp序列作为启动子区域，利用Plant CARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测，筛选具有注释功能的顺式作用元件，利用TBtools 1.112软件进行可视化处理。
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1.2.4 蛇足石杉COBRA基因家族的保守基序、表达量和系统发育分析
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通过MEME Suite5.5.1（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）预测基因家族的保守基序，利用TBtools 1.112软件进行可视化处理。通过计算每千个碱基的转录每百万映射读取的片段（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）均值，分析COBRA基因家族在蛇足石杉叶、孢子、茎、芽胞中的表达量，利用TBtools 1.112软件绘制基因表达量热图并进行美化。通过MEGA 11软件对蛋白序列进行多重比较，使用邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树（bootstrap=1 000），利用iTOL（http://itol.embl.de）对进化树进行美化。
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2 结果与分析
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2.1 蛇足石杉COBRA基因家族的理化性质分析
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从蛇足石杉全长转录组数据中共筛选出24条COBRA基因家族的碱基序列，分别命名为HsCOBRA1-HsCOBRA24，其碱基序列可通过图1：A获得。基于蛇足石杉转录组测序及ORF Finder获得氨基酸序列（图1：B）。利用ExPAsy在线软件对HsCOBRAs编码的蛋白质进行理化性质预测，结果见表1。24条HsCOBRAs蛋白序列中，蛋白氨基酸数量为73（HsCOBRA19）~663（HsCOBRA14）个。分子量在8 494.91（HsCOBRA15）~73 084.23（HsCOBRA14）Da之间，平均分子量为26 012.36 Da。9个蛋白（HsCOBRA1、HsCOBRA5、HsCOBRA6、HsCOBRA7、HsCOBRA9、HsCOBRA14、HsCOBRA16、HsCOBRA17、HsCOBRA18）等电点在4.53~6.97之间，为酸性蛋白，其余15个蛋白的等电点在8.17~10.13之间，为碱性蛋白。11个蛋白（HsCOBRA1、HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4、HsCOBRA6、HsCOBRA7、HsCOBRA11、HsCOBRA12、HsCOBRA13、HsCOBRA14、HsCOBRA23）为稳定蛋白，其余13个蛋白均为不稳定蛋白。HsCOBRAs家族成员的亲脂系数介于61.70~92.37之间；HsCOBRA7、HsCOBRA8、HsCOBRA9、HsCOBRA12、HsCOBRA15为疏水性蛋白，其余蛋白为亲水性蛋白。所有蛋白均带有负电残基3（HsCOBRA19）~77（HsCOBRA16）个及正电残基6（HsCOBRA15）~53（HsCOBRA5）个。
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图1 蛇足石杉COBRA基因家族的碱基序列（A） 及氨基酸序列（B）二维码
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Fig.1 The two-dimensional code of COBRA gene family base sequence （A） and amino acid sequence （B） of Huperzia serrata
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2.2 蛇足石杉COBRA基因家族亚细胞定位及信号肽分析
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跨膜结构预测发现7个蛋白（HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4、HsCOBRA9、HsCOBRA11、HsCOBRA12、HsCOBRA14）分别具有1个跨膜结构，其余均无跨膜结构。信号肽预测发现HsCOBRA2、HsCOBRA4、HsCOBRA14具有典型的GPI锚定蛋白N端信号肽，信号肽指数分别为0.975 8、0.975 8、0.999 8，其切割位点分别可能在N端的第41个和第42个、第41个和第42个、第28个和第29个氨基酸残基间；其余信号肽指数均小于0.5。亚细胞定位发现HsCOBRAs家族成员分布广泛，1个（HsCOBRA9）定位于细胞壁，4个（HsCOBRA6、HsCOBRA7、HsCOBRA10、HsCOBRA23）定位于叶绿体，10个（HsCOBRA1、HsCOBRA5、HsCOBRA7、HsCOBRA16、HsCOBRA17、HsCOBRA19、HsCOBRA20、HsCOBRA21、HsCOBRA22、HsCOBRA24）定位于细胞核，其余10个均定位于细胞膜。HsCOBRA7分别定位于叶绿体和细胞核，HsCOBRA10分别定位于叶绿体和过氧化物酶体，详见表2。
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2.3 蛇足石杉COBRA基因家族结构域分析
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蛋白结构域分析结果显示HsCOBRAs家族共有7种结构域 （图2），分别为COBRA、COBRA superfamily、 PI31_Prot_N、 PI31_Prot_C、 PI31_Prot_N superfamily、 RING_Ubox superfamily、TilS superfamily。其中，COBRA与COBRA superfamily分别分布在4个蛋白序列中，均注释为糖磷脂酰肌醇。除HsCOBRA1含有2个结构域外，13个蛋白（HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4、HsCOBRA5、HsCOBRA6、HsCOBRA7、HsCOBRA8、HsCOBRA12、HsCOBRA13、HsCOBRA14、HsCOBRA16、HsCOBRA17、HsCOBRA18）仅有1个结构域，其余10个蛋白无结构域。
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2.4 蛇足石杉COBRA基因家族二级结构分析
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利用Prabi软件对蛇足石杉COBRA基因家族进行二级结构预测，表3结果表明HsCOBRAs蛋白的二级结构均由无规则卷曲、α螺旋、延长链、及β折叠组成，所占比平均值分别为46.02%、29.34%、18.95%、5.70%。6个蛋白（HsCOBRA10、HsCOBRA19、HsCOBRA20、HsCOBRA21、HsCOBRA22、HsCOBRA23）中α螺旋占比最大（占38.27%~58.25%），其次为无规则卷曲；其余HsCOBRAs蛋白中的无规则卷曲比例最大（占38.67%~64.29%）；所有蛋白的β折叠所占的比例最小（占1.55%~14.81%）。
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图2 蛇足石杉COBRA基因家族结构域预测
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Fig.2 COBRA gene family domain prediction of Huperzia serrata
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2.5 蛇足石杉COBRA基因家族三级结构分析
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利用phyre2软件对蛇足石杉COBRA基因家族成员进行三级结构预测，表4和图3结果表明24个蛋白共有19种三级结构模型，HsCOBRA7氨基酸比例最高（81%），HsCOBRA13、HsCOBRA16、HsCOBRA19、HsCOBRA24均具有水解酶结构，HsCOBRA1、HsCOBRA6、HsCOBRA7均具有水解酶抑制剂结构，HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4、HsCOBRA14均具有碳水化合物结构。HsCOBRA6、HsCOBRA7、HsCOBRA17序列同源性为99.9%；HsCOBRA6和HsCOBRA7蛋白的三级结构相似，可能具有相似的生物学功能；HsCOBRA1和HsCOBRA5三级结构序列同源性为100%。
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2.6 蛇足石杉COBRA基因家族顺式作用元件分析
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顺式作用元件分析结果显示，HsCOBRAs共有45种具有功能注释的顺式作用元件（图4）。其中，有22种顺式作用元件参与光响应（MRE、Box 4、G-box、ACE、circadian、AE-box、GT1-motif、Sp1、3-AF1 binding site、CAG-motif、GA-motif、Gap-box、TCT-motif、chs-CMA2a、GATA-motif、LAMP-element、Box Ⅱ、I-box、AT1-motif、ATCT-motif、 GTGGC-motif、TCCC-motif）。部分蛋白具有参与分生组织表达（CAT-box）和胚乳表达（GCN4-motif）及响应脱落酸（ABRE）、生长素（TGA-element）、赤霉素（P-box、TATC-box）、水杨酸（TCA-element）的顺式作用元件，此外还含有响应厌氧（ARE）、缺氧（GC-motif）、干旱（MBS）、低温（LTR）等环境的顺式作用元件。CAAT-box元件的数量最多（306个），为启动子和增强子区域共有的顺式作用元件，分布于所有蛋白；其次是作为核心启动顺式作用元件的TATA-box（206个）和参与干旱诱导MYB结合位点的MBS（72个）。HsCOBRA18所含的顺式作用元件最多（78个），其次为HsCOBRA14（75个）和HsCOBRA24（69个），HsCOBRA7所含的顺式作用元件最少（10个）。部分顺式作用元件仅在一条蛋白中显示，如TCCC-motif（HsCOBRA5），3-AF1 binding site（HsCOBRA12），GTGGC-motif（HsCOBRA17），ACA-motif、Box Ⅱ-like sequence（HsCOBRA18），Box Ⅱ（HsCOBRA19），ATCT-motif、AT1-motif、A-box（HsCOBRA20），GA-motif、ACE（HsCOBRA23），TC-rich repeats（HsCOBRA24）。
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2.7 蛇足石杉COBRA基因家族保守基序分析
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HsCOBRAs保守基序结果表明，该家族共包含6种保守基序，命名为Motif 1-Motif 6（图5，图6）。其中，仅有13个蛋白拥有Motif，3个蛋白（HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4）所含的Motif最多，均为6种；7个蛋白（HsCOBRA1、HsCOBRA5、HsCOBRA7、HsCOBRA9、HsCOBRA10、HsCOBRA12、HsCOBRA24）仅有1种Motif。Motif 6分布最广，其次为Motif 1、Motif 3、Motif 4。Motif 3含有高度保守的CCVS结构，7个蛋白具有Motif 3。HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4（Motif 1-Motif 6）分别与HsCOBRA1、HsCOBRA6、HsCOBRA7（Motif 4）和HsCOBRA9、HsCOBRA10（Motif 6）具有相同种类的Motif。
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2.8 蛇足石杉COBRA基因家族组织表达模式分析
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根据COBRA基因在蛇足石杉叶、孢子、茎、芽胞中的转录组数据分析其表达模式，见图7。HsCOBRA2在4个组织中的表达量均最高，HsCOBRA4在叶、孢子、茎中的表达量仅次于HsCOBRA2。HsCOBRA7、HsCOBRA15、HsCOBRA20在4个组织中几乎不表达，此外还有3个基因（HsCOBRA6、HsCOBRA12、HsCOBRA23）在叶片中几乎不表达，1个基因（HsCOBRA21）在孢子中几乎不表达，4个基因（HsCOBRA6、HsCOBRA12、HsCOBRA13、HsCOBRA23）在茎中几乎不表达，4个基因（HsCOBRA4、HsCOBRA6、HsCOBRA21、HsCOBRA23）在芽胞中几乎不表达。COBRA基因家族在蛇足石杉中的表达量顺序为叶＞孢子＞茎＞芽胞；HsCOBRA2和HsCOBRA16在芽胞及孢子中表达量较高，可能参与蛇足石杉的繁殖。
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图3 蛇足石杉COBRA基因家族三级结构预测
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Fig.3 Tertiary structure prediction of COBRA gene family of Huperzia serrata
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2.9 蛇足石杉COBRA基因家族系统发育分析
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为了解蛇足石杉与蕨类植物COBRA基因家族的进化关系，构建蛇足石杉与江南卷柏（Selaginella moellendorffii）的COBRA家族成员的NJ系统发育树，见图8。序列比对发现HsCOBRA2、HsCOBRA3、HsCOBRA4、HsCOBRA11、HsCOBRA13、HsCOBRA14具有CCVS结构，分别位于蛋白序列的第238位和第241位、第268位和第271位、第238位和第241位、第20位和第23位、第109位和第112位、第431位和第434位氨基酸残基中，蛋白高度保守。图8结果表明，HsCOBRA1与HsCOBRA7、HsCOBRA2与HsCOBRA4、HsCOBRA16与HsCOBRA17具有同源性；蛇足石杉与江南卷柏COBRA基因家族成员之间具有一定的亲缘关系。
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3 讨论与结论
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本研究共筛选出24个蛇足石杉COBRA基因家族成员且多以碱性蛋白为主，二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋及延长链构成，大部分成员具有光响应顺式作用元件，与大白菜（廉瑞婷等，2022）、亚麻（齐燕妮等，2019）、高粱（元志成等，2020）、番茄（曹颖等，2012）、玉米（潘倚天和黄敏，2022）、茶树（艾安涛等，2021）等COBRA基因家族相似，说明这些物种中可能具有数量相近、性质和功能相似的家族成员。但研究也发现HsCOBRAs亚细胞定位与玉米、亚麻、谷子（任昂彦等，2021）中COBRA定位不同，提示不同物种的基因在进化过程中可能产生了某种特定功能的分化。HsCOBRAs中6个蛋白（HsCOBRA15、HsCOBRA19、HsCOBRA20、HsCOBRA21、HsCOBRA22、HsCOBRA23）无结构域及保守基序，并且在蛇足石杉4个组织中几乎不表达，该6个蛋白可能不属于蛇足石杉COBRA家族成员。
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图4 蛇足石杉COBRA基因家族顺式作用元件预测
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Fig.4 Cis-acting elements prediction of COBRA gene family of Huperzia serrata
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石杉碱甲在治疗阿尔茨海默病及益智中表现出时效长、副作用少的优势（陈思思等，2021），蛇足石杉作为石杉碱甲的主要来源之一，其基原植物的生长繁殖、产量与可持续发展备受人们关注。COBRA基因的主要功能是参与植物细胞扩增（廉瑞婷等，2022），通过调节植物的生长发育从而影响其生物量和产量。本研究发现，HsCOBRAs具有参与分生组织表达及胚乳表达的顺式作用元件，并且16个HsCOBRAs基因在叶、孢子、茎、芽胞4个组织中有不同程度的表达，尤其在叶和孢子中表达量最高，说明蛇足石杉COBRA基因家族参与到其叶、孢子、茎及芽胞的发育过程（杨兰锋等，2023）。前期研究发现，蛇足石杉大叶、老叶及孢子囊壁中均具有丰富的纤维素，提示HsCOBRAs基因家族可能通过调节纤维素及细胞壁生长、机械强度等参与蛇足石杉的生长发育过程，提高其生物量。孢子是蛇足石杉主要繁殖器官之一，HsCOBRAs基因家族可能影响其孢子囊壁的生长发育从而影响孢子的成熟和萌发。同时，该基因家族成员具有响应干旱、缺氧、低温、盐碱等非生物胁迫的顺式作用元件。其中，ACA能响应冷、热、盐胁迫和紫外等多种非生物胁迫（陈逃飞等，2023）；ABRE元件能与BpbZIP1特异性结合，响应盐胁迫，通过清除活性氧提高株系耐盐能力（郭依萍等，2020）；LTR反转录转座子能响应盐、ABA、H2O2和干旱等而发生转录水平的变化（周宾寒等，2023）。ACA、ABRE、LTR反转录转座子在HsCOBRAs基因家族启动子区域大量存在，说明蛇足石杉COBRA基因家族在植物应对非生物胁迫方面发挥作用。
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图5 蛇足石杉COBRA基因家族保守基序预测
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Fig.5 Conserved motif prediction of COBRA gene family of Huperzia serrata
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蛇足石杉COBRA基因家族具有与其他物种相似的生物信息学特征及规律，同时具有可能参与生长发育、繁殖及响应不良环境胁迫的生物学功能。通过研究蛇足石杉COBRA基因家族的分子生物信息学特征及组织表达规律，有助于阐明蛇足石杉COBRA基因的分子调控和促进生长发育机制，为生物量的增长提供新途径，为将来的分子育种及基因功能验证等研究提供理论依据。
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图6 蛇足石杉COBRA基因家族保守基序序列分析
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Fig.6 Conserved motif sequence analysis of COBRA gene family of Huperzia serrata
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图7 蛇足石杉COBRA基因家族的组织表达模式分析
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Fig.7 Tissue expression patterns analysis of COBRA gene family of Huperzia serrata
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图8 蛇足石杉与江南卷柏COBRA家族成员的系统发育树
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Fig.8 Phylogenetic tree of COBRA family members of Huperzia serrata and Selaginella moellendorffii
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摘要
为探明蛇足石杉COBRA基因家族成员分子生物信息学特征及组织表达规律，该文基于蛇足石杉的全长转录组数据，通过生物信息学技术对该家族成员（HsCOBRAs）的理化性质、结构域、保守基序、顺式作用元件、基因表达量等进行分析。结果表明：（1）在蛇足石杉全长转录组中共筛选出24个HsCOBRAs家族成员，其中酸性蛋白9个，稳定蛋白11个，疏水性蛋白5个，具有跨膜结构的蛋白7个，具有信号肽的蛋白3个。（2）亚细胞定位在细胞壁、叶绿体、细胞核、细胞膜上。（3）结构分析发现HsCOBRAs有7种结构域和6种保守基序，部分成员具有高度保守的CCVS结构。（4）HsCOBRAs具有CAAT-box、TATA-box等45种顺式作用元件。（5）HsCOBRA2在叶、孢子、茎、芽胞中的表达量均最高。该研究结果可为HsCOBRAs的进一步研究及生物学功能验证等提供理论依据。
Abstract
In order to clarify the molecular bioinformatics characteristics and tissue expression patterns of the COBRA gene family members of Huperzia serrata, the physicochemical properties, domains, conserved motifs, cis-acting elements, and genes expression of the family members (HsCOBRAs) were analyzed by bioinformatics techniques, based on the full-length transcriptome data of the H. serrata. The results were as follows: (1) A total of 24 HsCOBRAs family members were screened in the full-length transcriptome of H. serrata, including 9 acidic proteins, 11 stabilizing proteins, 5 hydrophobic proteins, 7 proteins with transmembrane structures, and 3 proteins with signal peptides. (2) Subcellular localization was found in the cell wall, chloroplast, nucleus, and cell membrane. (3) Structural analysis revealed that HsCOBRAs had 7 domains and 6 conserved motifs, and partial members had a highly conserved CCVS structure. (4) HsCOBRAs had 45 cis-acting elements such as CAAT-box and TATA-box. (5) HsCOBRA2 had the highest expressions in leaves, spores, stems and gemma. The study results can provide theoretical basis for further research and biological function verification of HsCOBRAs.
