摘要
裸子植物雪松（Cedrus deodara）为风媒传粉植物，其花粉萌发和花粉管生长速率明显比被子植物（如玉米）慢。淀粉是风媒植物花粉萌发的主要能量来源。为揭示雪松花粉淀粉粒的特征及其在花粉萌发过程中的变化，该研究以雪松和玉米的花粉为材料，通过生理生化、细胞学和蛋白质组学手段比较花粉萌发过程中淀粉粒的变化及其对花粉管生长的影响。结果表明：（1）与玉米成熟花粉相比，雪松花粉中的淀粉含量较低，但直链淀粉比例较高。（2）雪松花粉的淀粉粒呈不规则鹅卵石状，而玉米花粉的淀粉粒为短棒状。（3）雪松花粉中的α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性、同工酶种类和酶活性均低于玉米花粉。（4）雪松成熟花粉中的淀粉粒主要分布在花粉壁内侧的细胞质中，在花粉萌发过程中逐渐进入花粉管；同时，淀粉同工酶种类和酶活性增加，淀粉降解加强，可溶性糖含量增加，从而为花粉萌发提供能量。该研究为阐明裸子植物风媒花粉萌发和花粉管生长较慢的原因提供了新线索。
Abstract
The gymnosperm cedar(Cedrus deodara) is a wind-pollinated plant, and exhibits a significantly slower process of pollen germination and pollen tube growth than that of angiosperm (e.g., maize). Starch is the main energy source for pollen germination in wind-pollinated plants. To reveal the characteristics of starch granules in cedar pollen and their changes during pollen germination, the pollens of cedar and maize were used as materials to compare the changes of starch granules and their effects during pollen germination by physiological and biochemical, cytological and proteomic approaches. The results were as follows: (1) Compared with mature maize pollen, the starch content in cedar pollen was lower, but the amylose proportion was higher. (2) Starch granules in cedar pollen were irregular and cobblestone-like, whereas those in maize were short and rod-shaped. (3) The activities of α-amylase and β-amylase, and the types and activities of isoenzymes were much lower than those in maize pollen. (4) Starch granules in mature cedar pollen were primarily distributed in the cytoplasm around the inner pollen wall, and gradually moved into pollen tube during pollen germination. Meanwhile, the types and activities of starch isoenzymes increased, and the degradation of starch increased, thereby producing more soluble sugar to provide energy for pollen germination. This research provides new clues for understanding the reasons for the slow pollen germination and pollen tube growth of gymnosperms.
种子植物的花粉萌发和花粉管生长在有性生殖过程中起着至关重要的作用。花粉经柱头识别水合后萌发，随后花粉管发育并伸长从而将精子输送至卵细胞，与之结合形成合子，最终发育成种子（Zhang et al., 2021）。该过程在被子植物中通常需要数分钟或数小时，花粉萌发与花粉管生长速率均较为迅速。例如，玉米花粉落在花柱上5 min后便开始萌发，花粉管以1 000 μm·h-1的速度伸长（Bedinger, 1992; Bedinger & Fowler, 2009）。相比之下，裸子植物的花粉萌发和花粉管生长较为缓慢（Fernando et al., 2005; Williams, 2008; Breygina et al., 2021; Surso et al., 2023）。例如：南洋杉（Araucaria angustifolia）从授粉到萌发至少需要1个月，预授精需要12个月（Kuhn et al., 2024）；欧洲赤松（Pinus sylvestris）花粉粒的体外水合需要12~14 h（Surso et al., 2023）；贝壳杉（Agathis australis）花粉管的生长速率为6 μm·h-1（Williams，2008）；欧洲云杉（Picea abies）约为20 μm·h-1（Breygina et al., 2021）。
绝大多数裸子植物通过风媒传粉（Lu et al., 2011），花粉具有气囊结构（Tiwari et al., 2012），如雪松、黑松、马尾松等松科植物，而柏科植物的花粉通常没有气囊（Kurmann, 1994）。气囊结构不仅与裸子植物适应风媒传粉的特性有关，也与授粉机制有关。气囊是促进落在授粉液滴（胚珠分泌至珠孔的液滴）上的花粉粒进入珠孔，进而萌发的有效结构（Breygina et al., 2021）。
在花粉发育过程中，淀粉的积累和降解对花粉育性至关重要（Lee et al., 2022）。小孢子吸收的糖类被用作碳源，或者以淀粉粒的形式积累（Nashilevitz et al., 2009）。花粉中淀粉通常有1至2次的积累与降解周期（Lee et al., 2022）。第1次淀粉积累发生在减数分裂前期，第2次在小孢子有丝分裂之前（de Oliveira et al., 2015; Zhu & Tian, 2015）。在水稻AGPase突变体中，花粉粒的淀粉合成受抑制，导致雄性不育（Lee et al., 2016）。淀粉降解受α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉脱支酶和麦芽糖酶的调控（Goren et al., 2018）。番茄legwd突变体花粉中淀粉降解受阻，导致花粉育性降低（Nashilevitz et al., 2009）。在松杉类植物中，淀粉粒的位置随小孢子发育呈现动态变化。二分体时期，淀粉粒主要分布在细胞中央，而四分体时期，淀粉粒主要聚集在细胞质周边（Lü et al., 2003）。水松花粉中，淀粉粒在花粉发育早期出现，但在生殖细胞形成后会消失（肖德兴，1997）。
淀粉是风媒花粉的主要贮藏物质，为花粉萌发和花粉管生长提供碳骨架和能源（Kim et al., 2019）。花粉萌发和花粉管生长是高耗能的过程，需要众多淀粉代谢相关蛋白的参与（Fernando, 2005; Lee et al., 2022）。例如，棉花（Gossypium hirsutum）花粉在雌蕊中的生长速率与其贮藏淀粉含量呈正相关（Hu et al., 2019）。淀粉代谢显著调控花粉萌发和花粉管伸长的机制在被子植物（如水稻、玉米）中研究得较清楚（Liu et al., 2021; Chen et al., 2023）。玉米作为风媒植物，成熟花粉粒积累大量淀粉，其含量与花粉活力密切相关（Li et al., 2022; Li et al., 2023）。迄今，裸子植物（如雪松）花粉中的淀粉在花粉萌发和花粉管生长过程中变化及其作用尚不清楚。
为揭示淀粉粒在雪松花粉萌发和花粉管生长过程中的作用，本研究比较了雪松花粉和玉米花粉的淀粉粒形态和理化差异，尤其是淀粉粒在雪松花粉萌发过程中的变化。本研究对阐明裸子植物风媒花粉萌发和花粉管生长较慢的原因提供了新线索。
1 材料与方法
1.1 材料
选择处于散粉期的雪松，采集雄球花，收集花粉。选择散粉期的玉米植株（郑单958），收集成熟花粉，置于室内自然干燥。用滤网去除花粉中的杂质后，用于理化性质分析；其余的存放在-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 花粉的培养与观察
使用I2-KI溶液对成熟花粉染色，在光镜下观察。雪松花粉萌发实验参考田菊等（2012）的方法并适当改动。雪松花粉在26 ℃下培养，观察花粉的萌发情况。当花粉管长度大于花粉粒直径时，认定花粉已萌发。观察花粉总数不少于300粒，图片通过ToupView x86软件进行处理。
1.2.2 电镜样品的制备与观察
花粉及淀粉粒的扫描电镜观察参照Niu等（2019）的方法。花粉或淀粉粒依次在不同浓度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%和100%）中脱水10 min，在叔丁醇中脱水15 min。脱水后的样品在室温下风干，在离子溅射仪（JFC-1600 AUTO COATER, JEOL, Japan）中用金粒涂覆6次，每次30 s。使用场发射扫描电镜（SEM）（SU8010, Hitachi, Tokyo, Japan）观察花粉或淀粉粒形态。透射电镜的样品固定、脱水、包埋以及低温紫外聚合参照Li等（2021）的方法，在透射电子显微镜HT7700（Hitachi, Japan）下观察。使用CaseViewer 2.4软件处理图像。
1.2.3 淀粉粒的提取与纯化
淀粉粒的提取与纯化参照Niu等（2019）建立的两相法。取0.1 g雪松或玉米花粉，置于2 mL、50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中研磨。使用100 μm和30 μm细胞筛依次过滤花粉匀浆液。滤液5 000 g离心3 min，沉淀即为粗淀粉样品。依次向沉淀中加入600 μL的90%乙醇和1 200 μL的2.7 mol·L-1 NaH2PO4，混匀，5 000 g离心3 min；淀粉沉淀在离心管底部，用蒸馏水冲洗后晾干备用。
1.2.4 花粉淀粉相关理化性质测定
使用Megazyme试剂盒（K-TSTA-100A, Megazyme, Ireland）进行淀粉含量测定，具体方法参照说明书。参考Boonkor 等（2022）的方法测定糊化温度。采用差示扫描量热法（DSC, model DSC 1, Stare System, Mettler-Toledo, Greifensee, Switzerland）测定淀粉的糊化热性能[V（淀粉）∶V（蒸馏水）=1∶2.5]。采用标准碘比色法（王仪春等，2001）测定直链淀粉含量。淀粉在沸水浴中充分碱解，乙酸中和后，加入I2-KI溶液显色，在620 nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算直链淀粉浓度。
采用二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，具体方法参照说明书（BC0235，BC0035，北京索莱宝科技有限公司）。
1.2.5 花粉淀粉酶活性测定
使用试剂盒（BC2045，北京索莱宝科技有限公司）测定花粉中α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，具体方法参照说明书，计算总淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性。
1.2.6 花粉中淀粉同工酶活性分析
参考赵会君等（2008）的方法，采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）分析淀粉酶同工酶。花粉（0.01 g）在1.0 mL缓冲液（0.35 mol·L-1蔗糖、0.05 mol·L-1 Tris）中冰浴研磨，离心（12 000 g，10 min，4 ℃），上清液用于电泳分析。测定α-淀粉酶同工酶活性时，样品在70 ℃水浴中10 min以钝化β-淀粉酶同工酶。电泳结束后，蛋白胶在1.5%的可溶性淀粉溶液（0.2 mol·L-1乙酸溶液配制）中37 ℃孵育3 h，之后用0.2 mol·L-1乙酸溶液冲洗，加入I2-KI溶液染色20 min，拍照记录。
1.2.7 花粉中淀粉酶提取及其活性分析
称取0.01 g花粉，加入0.8 mL蒸馏水，研磨后匀浆液转入离心管中，在室温下摇晃提取15 min，室温离心（6 000 g，10 min）；收集上清液，加入蒸馏水定容至10 mL，摇匀，即为淀粉酶提取液，测定其中的蛋白质含量。配制0.1%玉米淀粉（Cat:LA1080，北京索莱宝科技有限公司）和可溶性淀粉（Cat:G8300，北京索莱宝科技有限公司）溶液，加入等蛋白量的雪松和玉米的淀粉酶提取液，根据还原糖的生成量比较2种花粉淀粉酶活性。
1.2.8 淀粉结合蛋白的提取与分析
淀粉结合蛋白的提取方法详见Niu等（2019）。淀粉样品于室温下在缓冲液（0.1 mol·L-1 Tris-HCl，pH 6.8，1% SDS，20 mmol·L-1 DTT，1 mmol·L-1PMSF）中剧烈摇晃20 min，提取淀粉粒表面结合松散的蛋白质。离心（12 000 g，10 min，4 ℃）后，上清液使用苯酚法提取蛋白质。去除表面蛋白后，沉淀在SDS缓冲液中煮沸20 min，提取淀粉粒内部紧密结合的蛋白质。重复提取2次。冷却后离心，上清液同苯酚抽提。蛋白质含量通过考马斯亮蓝染色法测定（Bradford, 1976）。SDS-PAGE用12.5%的凝胶在30 mA恒流下进行。电泳后，凝胶使用考马斯亮蓝G350染色，或通过半干法电泳转移系统（Trans-Blot SD, Bio-Rad, USA）将蛋白质转移到PVDF膜（GE healthcare）上。α-淀粉酶和β-淀粉酶的免疫印迹检测方法参照Niu等（2019）。转移后的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别与α-淀粉酶和β-淀粉酶的单克隆抗体（AS10 712，AS15 2895，Agrisera）（1/5 000稀释）孵育1 h；TBST冲洗膜后，与过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（1/2 000稀释）孵育1 h；冲洗后与化学发光HRP底物（Immobilonä Western, Millipore Corporation, Billerica, USA）孵育5 min。免疫印迹用Bio-Rad Fluor-S MultiImager检测拍照。
1.2.9 数据处理
每个处理包括3个生物学重复，采用GraphPad Prism 8、Adobe Photoshop和Adobe Illustrator软件进行数据统计处理和图表制作；使用Student’s t-test分析数据显著性差异。
2 结果与分析
2.1 花粉形态及淀粉粒观察
显微观察发现，雪松花粉带有2个气囊，由外壁的外层向外扩展而成（图1：A），玉米花粉呈近圆形（图1：B）。两种花粉中均存在碘染色的淀粉粒。透射电镜观察发现，雪松花粉的淀粉主要分布在近花粉内壁的细胞质中，而两侧气囊中无淀粉粒存在（图1：C、D）。扫描电镜下可以更清晰看到雪松花粉结构（图1：E、F）。
图
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雪松和玉米的花粉形态和淀粉粒观察
Fig.
1
Observation of pollen morphology and starch granules in cedar and maize
雪松和玉米花粉淀粉的形态和大小有明显差异（图2）。碘染色后在光镜下观察，雪松花粉淀粉粒呈现不规则形状，大小范围为1.5~5.5 μm；玉米花粉淀粉粒为短棒状，大小范围为0.5~3.5 μm（图2：A、B）。在扫描电镜下，雪松花粉淀粉粒像不规则的鹅卵石，玉米花粉淀粉粒为短棒状（图2：C、D）。
图
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雪松和玉米花粉淀粉粒的形态观察
Fig.
2
Morphology observation of starch granules from cedar and maize pollen
2.2 花粉淀粉的生理生化分析
雪松花粉和玉米花粉的淀粉含量存在显著性差异（图3：A），雪松花粉淀粉含量较低。雪松花粉淀粉的糊化温度为65 ℃，低于玉米74 ℃（图3：B）。淀粉糊化温度通常与直链淀粉含量呈负相关。淀粉组成测定表明，雪松花粉淀粉的直链淀粉含量显著高于玉米（图3：C）。
无论以可溶性淀粉或玉米淀粉为底物，玉米花粉的粗酶液比雪松的粗酶液降解淀粉的程度更高，产生的还原糖更多（图3：D）。另外，雪松花粉中α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性均显著低于玉米花粉（图3：E）。这些结果说明，雪松花粉的淀粉酶活性显著低于玉米花粉。
在相同的温度和pH条件下，外源α-淀粉酶和β-淀粉酶水解雪松花粉淀粉产生的还原糖显著低于玉米花粉（等淀粉量比较）（图3：F）。这说明，与玉米花粉相比，雪松花粉淀粉更难被淀粉酶水解，这可能与其淀粉粒中直链淀粉含量较高有关。
图
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雪松和玉米花粉淀粉的组成和理化性质比较
Fig.
3
Comparison of the composition and physicochemical properties of pollen starch between cedar and maize
2.3 淀粉结合蛋白的提取与分析
SDS-PAGE分析发现，雪松花粉和玉米花粉的结合蛋白带型存在明显差异，包括蛋白质条带的种类和丰度（图4：A）。免疫印迹分析表明，雪松花粉中存在2个主要的α-淀粉酶相关条带，而玉米花粉中至少有4个；雪松中仅检测到1条微弱的β-淀粉酶相关条带，而玉米花粉中有2个主要的条带（图4：B）。这说明，雪松花粉中α-淀粉酶和β-淀粉酶的种类和丰度明显低于玉米花粉。
SDS-PAGE分析表明，2种花粉的淀粉表面蛋白和内部结合蛋白均存在明显差异（图4：C）。尤其在60 kDa处，雪松花粉淀粉的内部结合蛋白丰度明显低于玉米花粉，该蛋白为颗粒结合淀粉合成酶GBSSI。另外，淀粉酶同工酶分析发现，玉米花粉中出现明亮的同工酶信号，而雪松花粉的信号较弱，并且二者淀粉酶的位置也不同（图4：D）。根据同工酶信号的范围和强度分析，雪松花粉的淀粉同工酶活性和种类明显少于玉米花粉。
图
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雪松和玉米花粉淀粉相关蛋白分析
Fig.
4
Analysis of protein associated with pollen starch in cedar and maize
2.4 雪松花粉萌发过程中淀粉粒的变化
雪松花粉萌发较慢，体外萌发36 h 时才见明显的花粉管生长，72 h时花粉管平均长度为73.8 μm（图5：A）。其间，花粉中淀粉粒的位置发生了明显变化：最初在细胞质中分散存在，逐渐富集到萌发孔处。随着花粉管的生长，淀粉粒进入花粉管中，最终到达花粉管尖端。在萌发过程中，花粉中的淀粉含量逐渐降低，而可溶性糖含量逐渐升高（图5：B）。与此一致，随着萌发时间的延长，花粉α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性均逐渐升高（图5：C），淀粉酶同工酶种类和活性增强（图5：D）。以上结果说明，在花粉萌发过程中，淀粉逐渐被淀粉酶降解为可溶性糖，以支持花粉管的生长。
图
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雪松花粉萌发过程中淀粉的降解
Fig.
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Starch degradation during cedar pollen germination
3 讨论
3.1 淀粉粒特征及其在萌发过程中的变化
本研究发现，雪松和玉米的花粉形状、花粉中淀粉粒形状和淀粉组成存在显著性差异。雪松花粉有2个气囊，花粉中的淀粉粒多为不规则形，而玉米花粉中的淀粉粒为规则短棒状。雪松花粉中总淀粉含量低，但直链淀粉含量高于玉米花粉。直链淀粉含量越高，淀粉粒的堆积越紧密，淀粉酶难以渗透，从而导致GBSS的酶活性降低（Zhang et al., 2006; Warren et al., 2011）。因此，直链淀粉含量低的淀粉粒对α-淀粉酶更敏感，水解速率较快（Dias et al., 2010）。于是，直链淀粉含量的差异可能是雪松花粉和玉米花粉萌发速率差异的原因之一。另外，本研究发现雪松花粉中淀粉粒的糊化温度明显低于玉米花粉，这也与直链淀粉含量和花粉粒结构的差异有关。
透射电镜观察发现，雪松花粉中的淀粉粒主要分布在细胞质外周，而不是储存在气囊中。这与以前松属花粉中淀粉的研究结果（Kim et al., 2018）一致。孔冬梅等（2001）报道称油松花粉中的淀粉粒会在萌发前转移到气囊中，这一现象可能是由于显微制片导致的假象。本研究表明，在雪松花粉萌发过程中，淀粉粒移动到花粉中部，并聚集在萌发孔处，随后进入伸长的花粉管中，这与黑松花粉萌发过程中淀粉粒的位置变化相似（李国平等，2007）。
3.2 淀粉粒结合蛋白和淀粉酶差异
淀粉粒中的蛋白质一部分结合在淀粉粒表面，另一部分结合在淀粉粒内部。内部结合蛋白通常是参与淀粉生物合成的酶复合物残余（Benmoussa et al., 2010; Ma et al., 2022）。在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺存在时，松属植物（如白松）花粉不能萌发且花粉管不能继续伸长，这说明松属的成熟花粉中缺少萌发和花粉管伸长所需的关键蛋白（Fernando et al., 2001; Fernando, 2005）。本研究发现，雪松花粉和玉米花粉中的淀粉粒表面蛋白与内部结合蛋白均存在显著性差异，尤其是雪松花粉中的淀粉水解酶及其同工酶活性显著弱于玉米花粉。这可能是雪松花粉和玉米花粉萌发速率差异的另一个关键原因。
淀粉作为花粉中的储能物质，需要经过淀粉酶降解才能转化为可被利用的葡萄糖、麦芽糖等，为花粉萌发提供能量（Sun et al., 2023）。本研究发现，在雪松花粉萌发过程中，淀粉含量随着花粉萌发过程不断降低，可溶性糖含量逐渐升高，这说明淀粉被逐渐降解为可溶性糖，为花粉管生长提供能量。与玉米花粉相比，雪松花粉的淀粉酶活性低，同工酶种类少且活性低；免疫印迹进一步显示，雪松花粉的α-淀粉酶和β-淀粉酶条带数量少、丰度低。因此，雪松花粉较低的淀粉酶活性可能是影响淀粉降解速率较慢的因素之一，进而影响花粉管的萌发速率。
需要指出的是，裸子植物较被子植物有着更为久远的演化历史，其花粉发育过程与被子植物存在显著性差异。因此，花粉淀粉代谢的差异只是雪松花粉和玉米花粉萌发差异的可能原因。在双子叶风媒植物中，花粉萌发和花粉管生长较快的种类是否与玉米花粉有类似的原因，需要进一步研究，这将有助于解释裸子植物风媒花粉萌发和花粉管生长普遍比被子植物风媒种类缓慢的现象。
4 结论
本研究表明，雪松花粉和玉米花粉中的淀粉粒在结构、形状和理化性质方面存在显著性差异。其淀粉结合蛋白也显著不同，尤其是雪松花粉中淀粉酶及其同工酶种类和酶活性均低于玉米。在花粉萌发过程中，雪松花粉中的淀粉粒逐渐进入花粉管中，淀粉同工酶种类和酶活性增加。本研究为阐明两类风媒植物花粉萌发和花粉管生长差异的原因提供了新线索。