摘要
为探明抗旱型和干旱敏感型马尾松家系幼苗在干旱胁迫下针叶挥发物组分的变化特征，该研究采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，分别对抗旱型和干旱敏感型马尾松幼苗不同阶段（正常培育、轻度干旱、重度干旱、干旱复水）的针叶挥发物组分和相对含量进行测定。结果表明：（1）检测和鉴定出马尾松幼苗针叶挥发物组分16种，其中单萜组分5种（α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、异松油烯），倍半萜组分9种（γ-榄香烯、胡椒烯、β-榄香烯、长叶烯、石竹烯、葎草烯、α-摩勒烯、γ-摩勒烯、δ-杜松烯），酯类组分2种（甲酸芳樟酯、乙酸龙脑酯）。（2）抗旱型和干旱敏感型马尾松针叶挥发物组成基本相同，并且主要由单萜和倍半萜组成，相对含量较高的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯等，主要化合物（相对含量>1%）的相对含量差异不显著。（3）在轻度干旱胁迫下，干旱敏感型家系针叶挥发物中单萜组分的相对含量急剧下降，其中α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量由未经干旱胁迫状态下的39.671%和14.383%分别下降至16.855%和5.048%；抗旱型家系在干旱胁迫下针叶挥发物中单萜组分相对含量有所降低（下降幅度远小于干旱敏感型家系），并且在干旱复水后单萜组分相对含量上升，有恢复至未经干旱胁迫状态下的趋势。（4）抗旱型马尾松幼苗在干旱胁迫时针叶挥发物组分相对含量变化小，干旱敏感型马尾松幼苗在干旱初期针叶挥发物组分急剧变化以适应外部胁迫；针叶中单萜组分（α-蒎烯、β-蒎烯）在干旱胁迫下的响应程度是干旱敏感型和抗旱型家系最显著的差别。该研究为马尾松针叶挥发物响应干旱胁迫机理研究奠定了基础，也为马尾松抗旱育种提供了思路。
Abstract
To investigate the variation characteristics of needle volatile components in seedlings from drought-resistant and drought-sensitive Pinus massoniana families under drought stress, this study used solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry to determine the components and relative contents of needle volatiles in drought-resistant and drought-sensitive P. massoniana seedlings at different stages (normal cultivation, mild drought, severe drought, and drought rewatering). The results were as follows: (1) Sixteen kinds of volatile components from pine needles of P. massoniana seedlings were detected and identified, including five monoterpenes (α-pinene, β-pinene, myrcene, limonene, and terpinolene), nine sesquiterpenes (γ-elemene, copaene, β-elemene, longipinene, caryophyllene, humulene, α-muurolene, γ-muurolene, and δ-cadinene) and two esters (linalyl formate and bornyl acetate). (2) The components of needle volatiles in seedlings of drought-sensitive and drought-resistant P. massoniana families were basically the same, and mainly composed of monoterpenes and sesquiterpenes; the compounds with relatively high relative contents included α-pinene, β-pinene, caryophyllene, etc., and there was no significant differences between the relative contents of the main components (relative content greater than 1%). (3) Under mild drought stress, the relative contents of monoterpene components in needle volatiles of sensitive families decreased sharply, in which the relative contents of α-pinene and β-pinene decreased from 39.671% and 14.383% in the normal cultivation state to 16.855% and 5.048%, respectively; under drought stress, the relative contents of monoterpenes in needle volatiles of drought-resistant families decreased (the decline range was much smaller than that of drought-sensitive families), and the relative contents of monoterpenes increased after drought rewatering, tending to return to the normal cultivation state. (4) The relative contents of volatile components in pine needles of drought-resistant P. massoniana seedlings changed little under drought stress, while those of volatile components of pine needles of drought-sensitive P. massoniana seedlings changed sharply in the early stage of drought to adapt to external stress; the response of monoterpene components (α-pinene and β-pinene) in needles to drought stress was the most significant difference between drought-sensitive and drought-resistant families. This study lays a foundation for the study of the mechanism of P. massoniana needle volatiles in response to drought stress, and provides ideas for P. massoniana drought resistance breeding.
Keywords
马尾松（Pinus massoniana）是广泛分布于我国南方的用材和树脂兼用树种，具有速生、丰产、耐贫瘠等优良特性，在工业用材、林产品加工、森林资源发展及生态服务功能中具有不可替代的作用（杨章旗，2015；杨章旗等，2018）。作为马尾松主要产区之一，广西因地形条件与季风活动等因素的综合作用，容易出现降雨量时空分布不均的情况，从而导致局部灾害性干旱气候的形成（李耀先等，2009；邹成林等，2019）。干旱不仅会严重降低马尾松的造林成活率，导致大量苗木死亡，造成巨大的经济损失，还会显著制约林木的生长速度，使马尾松的成材周期延长，进一步影响其在工业用材与生态服务等方面的功能发挥。
目前，研究人员对马尾松的抗旱研究已取得了一定的进展，研究方向主要集中在光合特性、生理指标、生物调控、抗性筛选等关键领域。在马尾松苗木生理响应方面，研究人员围绕干旱胁迫下苗木光合特性及相关生理指标的变化展开了深入探讨。从光合速率、气孔导度、蒸腾作用，以及脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量等生理指标入手，分析了干旱胁迫对马尾松苗木生理代谢的影响，为理解马尾松的抗旱生理机制提供了重要依据（王好运等，2018；胡晓健等，2020；邓秀秀等，2020；张金凤等，2021）。在生物调控措施方面，菌根化对马尾松苗木抗旱能力的促进作用与机理成为研究热点，菌根能够通过改善苗木根系吸收水分和养分的能力、调节苗木体内的激素平衡等途径，有效提高马尾松苗木的抗旱性，为马尾松抗旱造林提供了新的技术思路（王艺等，2019；王艺和涂桂英，2021；李敏等，2022）。此外，研究人员通过苗期干旱试验和大田试验对不同种源（刘建兵等，2010；韩文萍等，2012）和不同家系（杜明凤等，2017；唐生森等，2018；莫荣海等，2018）的马尾松进行了抗旱性能评价，筛选出抗旱性较强的优良种质资源。然而，在抗旱指标的选择上，多数研究仅关注单一或少数生理指标，缺乏对多指标综合考量及指标间关联性的深入分析，难以全面、准确地评价马尾松的抗旱能力。
挥发性物质是植物生长过程中重要的一类化合物，植物可以通过调整挥发性物质释放量及化学组成来应对各种生物或非生物胁迫。挥发性物质对干旱胁迫有较明显的响应，香樟（Cinnamomum camphora）幼苗受到干旱胁迫后，其挥发物种类和释放量增加（周帅，2012）。迷迭香（Rosmarinus officinalis）受到干旱胁迫后有新的挥发物形成，并且挥发物释放量下降（刘芳等，2014）。桦树（Betula pendula）受到干旱胁迫后会增加α-蒎烯和桧烯释放（胡书婧和张汝民，2022）。马尾松也会调节针叶挥发物的相对含量以响应干旱胁迫，全文选和丁贵杰（2017）研究表明，马尾松幼苗受到干旱胁迫后，针叶中单萜类化合物相对含量先降低后逐渐升高，倍半萜类化合物相对含量则先升高再逐渐降低。不同耐旱型马尾松在干旱胁迫过程中外观形态和生理指标存在差异（汪挺，2021），但是不同耐旱型马尾松家系幼苗在干旱胁迫过程中挥发物组成变化规律尚未被报道。
本研究以抗旱型和干旱敏感型两种马尾松家系幼苗为材料，通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）分别对抗旱型和干旱敏感型马尾松幼苗在不同干旱阶段下（正常培育、轻度干旱、重度干旱、干旱复水）针叶挥发物的组分和相对含量进行测定，拟探讨以下问题：（1）马尾松幼苗针叶挥发物的组成特点；（2）不同耐旱型马尾松家系幼苗针叶挥发物响应干旱胁迫的差异；（3）针叶挥发物作为抗旱性筛选指标的可行性。本研究旨在为马尾松抗性育种及抗旱机理研究提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于广西壮族自治区林业科学研究院苗圃大棚，该区域地理坐标为108°20′32″—108°21′10″E、22°50′22″—22°50′40″N，海拔80 m，属于亚热带季风气候，年平均气温为21.6 ℃，年平均湿度为80%，雨季主要集中在5—9月，旱季主要集中在10月至次年4月（汪挺等，2020）。
1.2 试验材料
基于前期马尾松幼苗抗旱家系筛选试验结果（汪挺等，2020），筛选出马尾松高度抗旱家系19-242和干旱敏感型家系19-223作为试验材料。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计
将1年生马尾松幼苗移栽至育苗盆中，每盆中装入等量的马尾松林下黄心土（初始pH值为5.14，田间持水率为29.59%）。干旱试验开始前正常浇水与管护，保持土壤处于湿润状态。选择生长状况良好、长势均匀的干旱敏感型和抗旱型马尾松家系 [1.5年生，苗高为（55±5）cm，地径为（5.3±0.5）mm]各36株。采用随机区组试验设计，设置3个随机区组，每组各12个单株。对试验幼苗开展持续干旱试验，在干旱处理0、10、15 d时土壤相对含水量分别为76.3%、57.5%和30.8%，分别属于正常培育（75%~80%，normal cultivation，CK），轻度干旱（55%~60%，mild drought，MD）和重度干旱（30%~35%，severe drought，SD），在干旱处理15 d后进行复水至湿润状态后48 h干旱复水（drought rewatering，RW）（汪挺，2021），分别在这4个时间点取适量针叶进行挥发物组分及相对含量的测定。
1.3.2 针叶挥发物组分分析
采用SPME-GC-MS对针叶挥发物的化合物组成及相对含量进行测定（国田等，2020）。取相同处理下的3株幼苗针叶，混合、剪碎后称取0.50 g放置于10 mL顶空瓶中，加入适量的无水硫酸钠（干燥剂），插入老化处理后的SPME萃取头，在75 ℃恒温浴锅内萃取15 min后，在Bruker气相色谱三重四极杆质谱仪（SCION SQ-TQ）中解析3 min后进行GC-MS 分析，每个处理3次重复。气相色谱条件：程序升温方法为在初始温度40 ℃下保持5 min，之后以5 ℃·min-1的升温速度升至150 ℃，再以2 ℃·min-1的升温速度升至160 ℃，最后以10 ℃·min-1的升温速度升至250 ℃后保持5 min。色谱柱为DB-5毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），检测器为氢火焰离子检测器（flame lonization detector，FID），载气为高纯氦气（99.999%），不分流。进样口和检测器温度均为250 ℃。柱前压为49.5 Pa，柱流量为1 mL·min-1。质谱条件：电子轰击源为EI，电子能量为70 eV，离子源温度为250 ℃，接口温度为250 ℃，扫描质量范围为40~450，扫描间隔为0.5 s，扫描时间设置为46 min。
1.4 数据处理
通过将所得质谱图与系统中NIST数据库的标准图谱比对，并结合相关文献对针叶挥发物组分进行定性分析（谢俊康等，2021）。采用面积归一化法对针叶挥发物组分进行定量分析。通过IBM SPSS 25软件进行独立样本t检验及方差分析。采用 Origin 8.5 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 针叶挥发物组分分析
通过SPME-GC-MS检测马尾松针叶挥发物化学组成和相对含量，检测结果如图1所示。共检测和鉴定出马尾松幼苗针叶挥发物组分16种，其中单萜组分5种（α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、异松油烯），倍半萜组分9种（γ-榄香烯、胡椒烯、β-榄香烯、长叶烯、石竹烯、葎草烯、α-摩勒烯、γ-摩勒烯、δ-杜松烯），酯类组分2种（甲酸芳樟酯、乙酸龙脑酯）。未经干旱处理（CK）的干旱敏感型及抗旱型马尾松家系幼苗针叶挥发物的组分及相对含量见表1。马尾松针叶挥发物主要由单萜和倍半萜组成（相对含量大于80%），其中相对含量最高的组分是α-蒎烯（约40%），相对含量较高的组分有β-蒎烯、柠檬烯、石竹烯、葎草烯、α-摩勒烯等。干旱敏感型和抗旱型家系的针叶挥发物组分基本一致，抗旱型家系针叶挥发物中α-蒎烯、柠檬烯、石竹烯的相对含量略高于干旱敏感型家系。干旱敏感型家系针叶挥发物中β-蒎烯、月桂烯的相对含量略高于抗旱型家系。独立样本t检验显示，除抗旱型家系针叶中乙酸龙脑酯相对含量显著高于干旱敏感型家系以外，其余组分的差异均不显著。
2.2 干旱胁迫对针叶挥发物的影响
2.2.1 干旱胁迫对干旱敏感型家系针叶挥发物的影响
图2展示了不同干旱胁迫阶段干旱敏感型家系主要针叶挥发物相对含量的变化情况。在CK状态下，针叶中β-蒎烯的相对含量显著高于MD、SD和RW；在MD状态下，针叶中α-蒎烯的相对含量显著低于CK、SD和RW，β-榄香烯、α-摩勒烯、γ-摩勒烯和δ-杜松烯的相对含量均显著高于CK、SD和RW；在SD状态下，针叶中石竹烯和葎草烯的相对含量均显著高于CK；在RW状态下，针叶中石竹烯相对含量显著高于CK和MD。在MD状态下，干旱敏感型家系的针叶中α-蒎烯和β-蒎烯等单萜组分的相对含量急剧下降，β-榄香烯、石竹烯、α-摩勒烯、γ-摩勒烯和δ-杜松烯等倍半萜组分的相对含量显著上升。持续干旱至SD状态时，α-蒎烯的相对含量开始上升，β-蒎烯的相对含量持续下降，石竹烯和葎草烯的相对含量持续上升，β-榄香烯、α-摩勒烯、γ-摩勒烯和δ-杜松烯的相对含量开始下降。结束干旱后复水至RW状态下，干旱敏感型马尾松家系主要针叶挥发物相对含量与SD状态下的差异不显著。
2.2.2 干旱胁迫对抗旱型家系针叶挥发物的影响
图3展示了不同干旱胁迫阶段抗旱型家系主要针叶挥发物相对含量的变化情况。在CK状态下，针叶中α-蒎烯、β-蒎烯的相对含量均显著高于MD和SD，α-摩勒烯的相对含量显著高于RW，石竹烯和葎草烯的相对含量均显著低于MD、SD和RW，δ-杜松烯的相对含量显著低于MD和SD。在MD状态下，抗旱型家系的针叶中α-蒎烯和β-蒎烯等单萜组分的相对含量有所下降，石竹烯、葎草烯和δ-杜松烯等倍半萜组分的相对含量有所上升。持续干旱至SD状态时，各主要针叶挥发物组分相对含量的变化均不大，与MD状态下差异均不显著。结束干旱后复水至RW状态后，抗旱型马尾松家系针叶挥发物中α-蒎烯、β-蒎烯等单萜组分的相对含量有所上升，石竹烯、葎草烯、α-摩勒烯和δ-杜松烯等倍半萜组分的相对含量有所下降。
2.2.3 干旱敏感型和抗旱型家系应对干旱胁迫时针叶挥发物响应的差异
对比干旱敏感型和抗旱型马尾松家系幼苗在应对干旱胁迫时针叶挥发物变化的差异发现，当受到干旱胁迫时，两类家系马尾松幼苗针叶挥发物组分基本不变，但是相对含量有较大变化，总体趋势为单萜组分的相对含量均下降，倍半萜组分的相对含量均上升。但是，干旱敏感型家系在MD状态下单萜组分显著下降，其中α-蒎烯的相对含量由CK状态下的39.671%下降至16.855%，β-蒎烯的相对含量由CK状态下的14.383%下降至5.048%（图2）。抗旱型家系在干旱胁迫初期单萜组分也有所下降，但是下降幅度较小，其中α-蒎烯的相对含量由CK状态下的45.598%下降至35.111%，β-蒎烯的相对含量由CK状态下的10.518%下降至4.776%（图3）。持续干旱至SD状态时，干旱敏感型家系针叶挥发物中单萜相对含量又显著上升，抗旱型家系针叶挥发物相对含量与CK状态下基本一致。干旱复水阶段抗旱型家系针叶挥发物组分有恢复至CK状态下的趋势。针叶中单萜组分（α-蒎烯、β-蒎烯）在干旱胁迫下的响应程度是干旱敏感型和抗旱型家系最显著的差别。
表
1
马尾松幼苗针叶挥发物组分及相对含量
Table
1
Components and relative contents of volatiles from needles of Pinus massoniana seedlings
注：相同字母表示在0.05水平差异不显著。
Note: The same letters indicate no significant differences at 0.05 level.
图
1
针叶挥发物SPME-GC-MS离子流图谱
Fig.
1
SPME-GC-MS ion chromatogram of needle volatiles
3 讨论与结论
针叶挥发物是马尾松的代谢产物，在马尾松受到生物或非生物胁迫时发挥重要作用。黄霖等（2025）研究了马尾松幼苗不同部位的挥发物组成，在针叶挥发物中共发现了24种化合物，其中含量较高的化合物有α-蒎烯（68.857%）、石竹烯（10.295%）、β-蒎烯（3.468%）等。全文选和丁贵杰（2017）的研究发现马尾松针叶挥发物中化合物共13种，其中相对含量较高的化合物有α-蒎烯（31.54%）、石竹烯（23.06%）和α-水芹烯（14.35%）。在本研究中，共检测和鉴定出针叶挥发物16种，相对含量较高的化合物有α-蒎烯、石竹烯和β-蒎烯。针叶挥发物的化合物种类丰富度和相对含量差异可能由材料来源和取样时间差异引起。马尾松针叶挥发物主要由单萜和倍半萜组成，其中单萜的相对含量高于倍半萜，相对含量较高的单萜和倍半萜化合物分别为α-蒎烯和石竹烯。Xie等（2022）通过水蒸气蒸馏法提取了马尾松针叶的精油，发现马尾松精油中主要化合物与本研究中针叶挥发物一致。
图
2
干旱胁迫对干旱敏感型家系主要针叶挥发物的影响
Fig.
2
Effects of drought stress on main needle volatiles in drought-sensitive families
图
3
干旱胁迫对抗旱型家系主要针叶挥发物的影响
Fig.
3
Effects of drought stress on main needle volatiles in drought-resistant families
马尾松挥发物的释放会受到环境变化的影响，在不同条件下可以合成与释放不同组合的萜类挥发物。李玲玉等（2020）研究表明，在短期干旱实验中，马尾松针叶中单萜烯和倍半萜烯的释放水平提升，分别是未受胁迫时的2.9倍和2.0倍。全文选和丁贵杰（2017）的研究结果表明，马尾松幼苗受到干旱胁迫后针叶挥发物变化的总体情况为单萜类化合物相对含量先下降后上升，倍半萜类化合物相对含量先上升后下降。本研究与上述研究结果基本一致。但是，本研究通过进一步对比不同耐旱型马尾松家系幼苗在对干旱胁迫时的响应情况，发现了两点主要区别：第一点为MD阶段的变化幅度，第二点为持续干旱过程的波动情况。具体表现为干旱敏感型家系在MD阶段单萜类化合物降幅较大，且在持续干旱至SD阶段干旱敏感型家系单萜类化合物又迅速上升（波动大）。抗旱型马尾松家系在MD阶段单萜组分的相对含量下降幅度较小，持续干旱至SD阶段，针叶挥发物各组分与MD阶段基本保持一致，且在干旱复水后单萜、倍半萜相对含量有恢复至未胁迫状态下的趋势。
基于干旱敏感型和耐旱型马尾松家系针叶挥发物组分的相对含量对干旱胁迫的响应差异明显这一特点，可将针叶挥发物组分变化纳入松树抗旱性评价指标，开展挥发物在胁迫过程中变化情况的研究或将成为优质种质资源选择的新途径。针叶挥发物是马尾松次生代谢产物，其合成、释放受基因及环境等因素的调控。导致不同耐旱型马尾松家系响应干旱胁迫时挥发物化学组分相对含量差异的关键因素仍需进一步研究探讨。
马尾松幼苗在受到干旱胁迫时，针叶挥发物中单萜组分的相对含量下降，而倍半萜组分的相对含量上升。干旱敏感型家系在MD状态下单萜组分急剧下降，持续干旱至SD过程中各组分相对含量变化显著；抗旱型家系在MD状态下单萜组分下降幅度小，且在持续干旱过程中各组分相对含量变化不显著。不同耐旱型马尾松家系在干旱胁迫下，针叶挥发物组分相对含量变化趋势有所差别，研究马尾松在非生物胁迫过程中针叶挥发物的变化情况可为抗性育种提供新的思路。