摘要
我国北方冷凉果产区生长季初期根区低温会限制根系功能恢复和地上部组织的生长发育。为探究外源γ-氨基丁酸（GABA）对根区亚低温下山定子（Malus baccata）幼苗根系线粒体功能的生理效应，该文以一年生山定子实生苗为研究对象，设置根区亚低温（5 ℃）处理，分别施加外源GABA（10 mmol·L-1）及其代谢抑制剂氨己烯酸（VGB，0.1 mmol·L-1），于处理后0、2、4、6、12、24 h测定根系线粒体膜透性、细胞色素c/a值、呼吸代谢途径、能量物质含量及抗氧化酶活性等指标。结果表明：（1）与对照相比，5 ℃亚低温下，山定子幼苗根系线粒体的结构与功能发生变化，具体表现为膜透性增强，细胞色素c/a值下降，总呼吸速率加快，细胞色素途径（CP）和交替途径（AP）的活性提高，同时交替氧化酶基因（AOX）的转录水平也明显上调。（2）与单纯亚低温处理相比，外源GABA处理能显著提高线粒体膜稳定性和c/a值，促进CP呼吸及其贡献率，抑制AP呼吸与AOX基因表达，同时维持较高的三磷酸腺苷（ATP）含量与能荷水平，并降低一磷酸腺苷（AMP）积累。（3）外源GABA处理能有效提升植株的抗氧化防御体系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX），减少丙二醛（MDA）生成，并促进根系活力的提高。（4）VGB处理能加剧线粒体膜损伤和能量代谢紊乱，抑制抗氧化酶活性。综上认为，外源GABA通过保护线粒体膜结构完整性、优化呼吸途径分配、维持细胞能量稳态且增强抗氧化能力，缓解根区亚低温对山定子根系的胁迫损伤，该作用依赖于完整的GABA代谢途径。该研究结果为提高山定子根系耐寒性提供了理论依据，对苹果抗寒砧木的培育具有重要意义。
Abstract
During the early growth season in cold fruit-producing regions of northern China, low temperatures in the root-zone restrict the recovery of root function and the growth and development of above-ground tissues. In response to the climatic characteristics of early spring in Northeast China’s cold-temperate fruit production areas — namely, rapid temperature recovery with large fluctuations and relatively delayed soil warming, this study aimed to explore the regulatory mechanism of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) on mitochondrial function in root-zone of one-year M. baccata under sublow-temperature, using M. baccata seedlings as experimental material, and the seedlings were subjected to a root-zone sublow-temperature treatment at 5 ℃ and applied exogenous GABA (10 mmol·L-1) or its metabolic inhibitor, vigabatrin (VGB, 0.1 mmol·L-1), respectively. Mitochondrial membrane permeability, cytochrome c/a value, respiratory metabolic pathways, energy substance contents, and antioxidant enzyme activities in roots were measured at 0, 2, 4, 6, 12 and 24 h after treatments. The results were as follows: (1) Compared with the control, 5 ℃ sublow-temperature significantly increased mitochondrial membrane permeability, decreased the cytochrome c/a value, and enhanced total respiration rate, activities of the cytochrome pathway (CP) and alternative pathway (AP), and induced upregulation of the alternative oxidase gene (AOX) expression. (2) Compared with sublow-temperature treatment alone, exogenous GABA treatment significantly improved mitochondrial membrane stability and c/a value, promoted CP respiration and its contribution rate, inhibited AP respiration and AOX gene expression, while maintaining higher adenosine triphosphate (ATP) content and energy charge level and reducing adenosine monophosphate (AMP) accumulation. (3) Exogenous GABA treatment also increased the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX), decreased malondialdehyde (MDA) content, and enhanced root vigor. (4) VGB treatment aggravated mitochondrial membrane damage and energy metabolic disorder, and inhibited antioxidant enzyme activities. In conclusion, exogenous GABA effectively alleviates root-zone sublow-temperature stress injury in M. baccata roots by protecting mitochondrial membrane integrity, optimizing respiratory pathway allocation, maintaining cellular energy homeostasis and enhancing antioxidant capacity, and this effect depends on an intact GABA metabolic pathway. These findings provide a theoretical basis for improving cold tolerance of M. baccata roots and are of great significance for breeding cold-resistant apple rootstocks.
山定子（Malus baccata）是一种蔷薇科（Rosaceae）苹果属（MalusMill.）的植物，以其发达的根系和极强的耐寒性而著称，是我国东北冷凉苹果产区广泛应用的抗寒砧木。山定子作为苹果嫁接砧木，不仅能增强接穗品种的抗逆性，而且还能调控树体生长势，影响果实品质和产量，在苹果生产中具有不可替代的重要地位。然而，东北地区早春的气候特征表现为气温回升迅速且波动剧烈，而土壤温度的上升则相对缓慢，这种根区温度与气温的非同步变化导致根系长期处于5 ℃左右的亚低温环境，造成根系吸收功能下降、代谢紊乱，进而影响地上部萌芽抽梢，严重时导致整个植株生长受阻。因此，如何提高山定子根系对根区亚低温的适应能力，是保障苹果产业可持续发展的关键之一。关于山定子的耐寒性，前人已从生理生化及分子层面开展了研究。如山定子在低温胁迫下能通过积累可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质，增强细胞膜的稳定性，同时激活抗氧化酶系统以清除过量活性氧（reactive oxygen species，ROS），减轻氧化损伤（Gharechahi et al., 2014；李金涛等，2025）。近年来，随着研究的深入，线粒体作为细胞能量代谢和逆境响应的中心，其在山定子抗寒中的作用日益受到关注。线粒体作为呼吸作用的主要场所（陈楠楠和薛一涛，2022），为细胞生命活动提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和碳骨架（Ji et al.,2020），而低温胁迫则会降低膜流动性，破坏电子传递链复合物的活性，从而导致ROS爆发，进而引起线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放、细胞色素c泄漏等一系列功能紊乱，最终影响植株的正常生长（Jing et al., 2016; Schwarzländer & Fuchs, 2017; Kerbler et al., 2019）。
呼吸作用是植物能量代谢的核心过程，通过氧化分解有机物产生ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及多种中间代谢物，为植物生命活动提供能量。由于温度的高低直接影响植物生长等生理活动（Taylor et al., 2005; 罗虹霞，2017; 李星星等，2018；Turk & Genisel, 2020; Jia et al., 2022），因此低温胁迫（low-temperature stress，LTS）是非生物胁迫的主要因子之一（Chen et al., 2026)。低温会降低光合效率及氧气利用能力，破坏ROS生成与清除之间的稳态，这会引起线粒体膜流动性降低，使活性氧大量累积，从而对植株的代谢功能造成不利影响（隽加香，2015；Hussain et al., 2018；李金涛等，2025）。线粒体作为呼吸作用的主要场所（陈晓晶等，2021），负责细胞内的物质转化与能量合成，在植物生长及逆境响应中具有关键作用（鲁晓峰等，2021）；同时，线粒体也是逆境中最易受损的细胞器之一，其功能正常与否直接影响植物对生物胁迫及非生物胁迫的抵抗能力。近年来有研究发现，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的分解代谢发生在线粒体中。例如在逆境胁迫下，由于植物细胞质中快速合成的GABA可以转运至线粒体，并经分解生成琥珀酸进入三羧酸循环，因此GABA支路被视为逆境下碳氮代谢的重要枢纽(Wang et al., 2014)。在动、植物体中，普遍存在一种非蛋白质的氨基酸分子（即GABA），当植物遭遇逆境时，它会启动GABA合成及相关代谢途径，并进而触发多种生理响应机制。吴丹丹等（2026）研究表明，GABA处理能通过调节植物能量代谢与相关代谢途径，有效缓解多种非生物胁迫对植物生长的抑制作用，如在低温贮藏条件下，GABA处理可以提高ATP与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide ademine dinucletotide，NADH）的水平，并增强能量供应，这表明GABA处理可以促进能量供应。这些表型改善可能与GABA对代谢通路的调控密切相关。
山定子根系的抗寒性与植株整体生长状况密切相关，提高其根系耐寒性对培育优良苗木具有重要意义。刘小跃（2022）研究指出，在5 ℃亚低温条件下，山定子根系线粒体会发生反应以适应该变化，同时能量代谢也会发生改变。然而，目前关于山定子根系在根区亚低温下的能量代谢响应研究较少，并且外源GABA通过调节线粒体功能来增强其耐寒性等方面尚缺乏系统研究。因此，为了进一步探究外源GABA对根区5 ℃亚低温下山定子幼苗根系线粒体功能的调控作用与机制，本研究针对我国东北冷凉果产区早春的气候特点，以一年生山定子实生苗为研究对象，采用根区温度监控与外源物质灌根相结合的方法，通过设置根区5 ℃亚低温处理、外源GABA处理及其代谢抑制剂氨己烯酸（vigabatrin，VGB）处理，系统测定了根系线粒体膜透性、细胞色素c/a值、呼吸代谢途径、能量物质含量及抗氧化酶活性等指标，分析外源GABA在根区亚低温下对线粒体功能的调控作用机制，以期为提高山定子根系耐寒性提供理论依据和技术参考。本研究拟探讨的科学问题如下：（1）根区5 ℃亚低温下，山定子幼苗根系线粒体的响应特征；（2）外源GABA缓解根区5 ℃亚低温胁迫的生理调控机制；（3）GABA代谢通路的完整性是否在这一调控过程中发挥关键性作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试材为一年生山定子实生苗，当年采摘处理的种子经低温层积打破休眠后，进行催芽，观察到种子出现露白后播种于穴盘。待幼苗生长至4片真叶阶段，将其移植至盛有混合基质的12 cm × 13 cm营养钵内，完成后续培育过程。同年9月，将幼苗换盆至16 cm × 16 cm营养钵内，冬季采取防寒措施越冬，于次年4月中旬开展正式试验。
1.2 试验处理
选取长势一致且无病虫害的山定子幼苗，在光照14 h/20 ℃、黑暗10 h/10 ℃的人工气候室中预培养2 d。预培养结束后，在保持气候室环境条件不变的前提下，设置4个处理组，具体如下：（1）5 ℃亚低温处理：将幼苗放在低温槽中培养，槽中根区温度控制在5 ℃；（2）γ-氨基丁酸（GABA）处理：将幼苗放在土壤浇灌10 mmol·L-1 GABA溶液的5 ℃低温槽中；（3）氨己烯酸（VGB）处理：幼苗置于土壤浇灌0.1 mmol·L-1 VGB溶液的5 ℃低温槽中；（4）对照组（CK）：幼苗在自然根区温度条件下（光照14 h/20 ℃、黑暗10 h/10 ℃）生长。分别于处理后0、2、4、6、12、24 h进行取样，每个时间点选取3株幼苗，设置3次重复，每次取样共计9株。
1.3 试验方法
1.3.1 呼吸速率测定
根系呼吸方法参照Bouma等（2001）的方法；呼吸途径速率和呼吸途径贡献率的计算参照Zhang等（2012）的方法。
1.3.2 线粒体提取和相关指标测定
1.3.3 能量物质含量测定
参照Liu等（2016）的方法提取山定子根系ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP），含量测定参照李栋（2021）的方法中的高效液相色谱检测条件。
1.3.4 基因表达量测定
采用OMEGA试剂盒（Plant RNA Mini Kit R6827-01）提取样品总RNA，检测细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）和交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）基因的表达量。使用微体积分光光度计测定RNA浓度，采用大连宝生物（Takara）反转录试剂盒构建RNA反转录反应体系，参照Livak和Schmittgen（2001）的方法。
1.3.5 抗氧化酶活性的测定
采用 He 等（2011）的方法对超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性进行测定；抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性测定则参照 Polle 等（1990）的描述进行。
1.3.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定
参照 Lei 等（2007）的方法测定MDA含量。
1.4 数据统计与分析
使用WPS Office、SPSS Statistics 21软件对数据进行处理和分析，采用单因素分析法进行方差比较，采用Duncan方法进行多重比较，采用Origin 2018软件绘制图表，在图表中用字母标注显著性，并在图中添加误差棒。
2 结果与分析
2.1 根区5 ℃亚低温下GABA对山定子根系线粒体功能变化的影响
2.1.1 对线粒体膜吸光度的影响
在波长为540 nm时，吸光度越高，膜通透性反而越低，二者呈显著负相关（Huang et al., 2019）。在本试验中，根区5 ℃亚低温处理下山定子根系线粒体膜在 540 nm 处的吸光度较对照（CK）显著降低，而且持续降低，这说明线粒体功能已经受到了不利影响。由图1可知，GABA处理下膜吸光度较5 ℃处理显著提高（除2 h以外），在4 h时达到峰值，较5 ℃处理提升了16.36%，但仍未超过CK处理；而VGB 则使吸光度进一步降低且在24 h 内显著低于5 ℃处理。上述结果表明，外源GABA可缓解亚低温对根系线粒体结构造成的损伤（图1）。
图
1
根区5 ℃下不同处理对山定子线粒体膜吸光度的影响
Fig.
1
Effects of different treatments on mitochondrial membrane absorbance in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.1.2 对细胞色素c/a值的影响
试验结果（图2）显示，5 ℃处理下，根系c/a值显著低于CK组；与5 ℃处理相比，GABA处理可提高c/a值（除6、12 h以外，其余时间点均达显著性差异），2 h达峰值（1.058），但仍低于CK组；VGB处理会进一步降低c/a值，在6~24 h内c/a值与其他处理组存在显著性差异。这表明，在5 ℃条件下，在一定程度上GABA能够抑制Cyt c从线粒体膜上的脱落。
图
2
根区5 ℃下不同处理对山定子线粒体细胞色素c/a值的影响
Fig.
2
Effects of different treatments on cytochrome c/a values in mitochondria of Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.2 根区5 ℃亚低温下GABA对山定子根系呼吸代谢的影响
2.2.1 对总呼吸速率的影响
根系总呼吸速率反映了根系对碳水化合物、脂肪酸等底物的氧化分解能力，是衡量根系代谢活性的核心指标。试验结果（图3）显示，亚低温（5 ℃）处理下，根系总呼吸速率在2~12 h内维持较高水平并显著高于CK组。外源GABA 处理使总呼吸速率进一步提高，12 h达到峰值，较亚低温处理提升12.35%；而VGB处理则显著抑制总呼吸速率，在2、4、6、12 h时均显著低于5 ℃处理组。上述结果表明，外源GABA可增强亚低温条件下山定子根系的总呼吸强度，提升底物代谢能力。
图
3
根区5 ℃下不同处理对山定子根系总呼吸速率的影响
Fig.
3
Effects of different treatments on total root respiration rates of Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.2.2 对细胞色素途径（cytochrome pathway，CP）呼吸速率及贡献率的影响
CP以NADH和FADH2为电子供体，是线粒体通过氧化磷酸化合成ATP的主要电子传递路径。与CK组相比，5 ℃亚低温处理显著提高了CP呼吸速率（除6 h以外），CP呼吸贡献率也显著升高（除4、6 h以外）。外源GABA处理可进一步促进CP呼吸速率，在12 h达到峰值，较5 ℃提升68.12%，同时显著提高CP呼吸贡献率（除2、24 h以外）；VGB处理则表现出相反效应，除4、6 h以外，其余时间点的CP呼吸速率及贡献率均显著低于5 ℃处理组（图4）。
2.2.3 交替途径（alternative pathway，AP）的呼吸速率和贡献率的变化
AP可快速消耗呼吸链中过量的还原力（NADH、FADH2），减少ROS的生成，是植物应对逆境胁迫的重要呼吸调控途径（胡文海，2007；冯汉青等，2020）。与CK相比，5 ℃处理提高了AP呼吸速率（2~24 h呈持续上升趋势）及贡献率（24 h达最大值34.97%）；GABA 处理降低了AP 呼吸速率与贡献率（6 h 除外）；VGB处理同样抑制AP呼吸速率及贡献率，表现为2~6 h逐渐下降，12 h达峰值后回落（图5）。上述结果表明，亚低温胁迫可激活AP呼吸途径，而外源GABA可进一步抑制AP活性，促使呼吸代谢向高效产能的CP途径倾斜。
2.3 根区5 ℃亚低温下GABA对根系关键酶基因表达量的影响
2.3.1 细胞色素氧化酶基因（COX）表达量的变化
COX是CP途径的末端关键氧化酶，参与电子传递和质子动力势的建立，直接影响ATP合成效率。试验结果（图6）显示，5 ℃亚低温处理显著上调COX1和COX2基因表达量，二者在2~24 h内呈逐渐上升趋势，6 h达到峰值（1.39、2.24）；外源GABA处理可进一步提升COX1基因表达量，同时维持COX2基因在高水平稳定表达；VGB处理则显著抑制二者表达，其中COX1基因在24 h时表达量显著下降，COX2基因在12~24 h内呈逐步下降趋势。这表明在亚低温胁迫条件下，外源GABA能够上调COX基因的表达水平，从而增强CP途径的运行效率。
图
4
根区5 ℃下不同处理对山定子细胞色素途径呼吸速率和贡献率的影响
Fig.
4
Effects of different treatments on cytochrome pathway (CP) respiration rates and its contribution rates of Malus baccata under root-zone 5 ℃
图
5
根区5 ℃下不同处理对山定子交替途径呼吸速率和贡献率的影响
Fig.
5
Effects of different treatments on alternative pathway (AP) respiration rates and its contribution rates in Malus baccata under root-zone 5 ℃
图
6
根区5 ℃下不同处理对山定子COX基因相对表达量的影响
Fig.
6
Effects of different treatments on relative expressions of COX gene in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.3.2 交替氧化酶基因（AOX）表达量的变化
交替氧化酶是AP途径的末端氧化酶，通过调节呼吸代谢以平衡适应逆境胁迫，减少ROS的积累（Polidoros et al., 2009）。试验结果（图7）表明，在5 ℃亚低温处理下，AOX基因的表达量明显上调，并且在2~24 h内都维持稳定的高水平表达。外源GABA与VGB处理均能下调AOX基因表达量，其中VGB处理的抑制效果更显著，4 h降到最低值1.054。这表明，亚低温胁迫可诱导AOX基因表达，而外源GABA可抑制该诱导效应，削弱AP途径活性。
图
7
根区5 ℃下不同处理对山定子 AOX基因相对表达量的影响
Fig.
7
Effects of different treatments on relative expressions of AOX gene in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.4 根区5 ℃亚低温下GABA对根系能量代谢途径的影响
2.4.1 根区亚低温下三磷酸腺苷（ATP）含量的变化
ATP是细胞代谢的直接能量来源，为物质运输、酶促反应、细胞分裂等生命活动提供即时能量，其含量变化直接反映细胞能量供应状态。试验结果（图8）显示，5 ℃亚低温处理破坏了细胞能量代谢平衡，导致2~12 h内ATP含量显著下降，推测与低温抑制代谢酶活性及降低ATP合成效率有关；与单纯5 ℃处理相比，外源GABA处理可通过促进ATP合成或抑制ATP分解，显著提高ATP含量，使细胞能量维持在较高水平，24 h达到峰值，此时相较于低温处理升高21.8%；VGB处理则呈现相反效应，除4、6 h以外，其余时间点ATP含量均低于5 ℃处理组且2~12 h内呈持续下降趋势，后续虽略有回升，但整体能量水平仍较低。上述结果表明，外源GABA可促进亚低温条件下山定子根系ATP积累，为低温胁迫下细胞正常生理功能提供能量保障。
图
8
根区5 ℃下不同处理对山定子三磷酸腺苷含量的影响
Fig.
8
Effects of different treatments on ATP contents in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.4.2 根区亚低温下二磷酸腺苷（ADP）含量的变化
ADP在能量代谢中可通过酶促反应转化为ATP，其含量变化反映细胞能量转化效率。试验结果（图9）显示，5 ℃处理下，ADP含量在2、4 h时显著降低，12~24 h则升高并维持高水平；外源GABA处理可使ADP含量在整个处理周期内持续维持较高水平且24 h达到峰值，较5 ℃处理升高了9.5%；VGB处理在2、4 h时与5 ℃处理组无显著性差异，6~24 h则显著降低ADP含量。这表明外源GABA有利于亚低温胁迫下山定子根系ADP的积累，为ATP合成提供充足底物。
图
9
根区5 ℃下不同处理对山定子二磷酸腺苷含量的影响
Fig.
9
Effects of different treatments on ADP contents in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.4.3 根区亚低温下一磷酸腺苷（AMP）含量的变化
AMP由ADP转化生成，该过程伴随能量释放，其含量变化反映细胞能量代谢的应急调节状态。试验结果（图10）显示，亚低温处理下，根系AMP含量在2~24 h内显著升高，推测与低温胁迫下细胞能量代谢重构及ADP向AMP转化增强有关；外源GABA处理则显著降低AMP含量，24 h降到最低值，较5 ℃处理降低17.43%，提示GABA可能通过抑制ADP向AMP转化或促进AMP进一步代谢，减少AMP积累；VGB处理下，AMP含量呈逐渐下降趋势，但各时间点仍显著高于GABA处理组（除24 h以外）且略高于5 ℃处理组，表明VGB对AMP含量的调控效果弱于GABA，但仍具有一定调节作用。综上，5 ℃亚低温可促进根系AMP积累，而外源GABA可有效抑制这一过程。
图
10
根区5 ℃下不同处理对山定子一磷酸腺苷含量的影响
Fig.
10
Effects of different treatments on AMP contents in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.4.4 根区亚低温下能荷（energy charge，EC）的变化
能荷（EC）计算公式为EC=(ATP+ 1/2ADP)/(ATP+ ADP+ AMP)，其可调控细胞代谢速率。试验结果（图11）表明，5 ℃处理在 2~24 h 显著降低EC；GABA 处理与5 ℃处理相比较，显著提高了EC，与对照处理相比，EC提高并不显著；VGB处理则使EC维持在较低水平，进一步加剧能量代谢紊乱。这表明外源GABA可在亚低温胁迫下提升山定子根系EC水平，维持细胞正常代谢活性。
图
11
根区5 ℃下不同处理对山定子能荷变化的影响
Fig.
11
Effects of different treatments on EC in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.5 根区5 ℃亚低温下GABA对根系抗氧化系统的影响
2.5.1 抗氧化酶活性的变化
由图12可知，5 ℃处理下，超氧化物歧化酶（SOD）活性在2、24 h分别较CK组提高15.95%、23.19%，其余时间点与CK组无显著性差异；外源GABA处理可进一步提高SOD活性，2~24 h内均显著高于5 ℃处理组，24 h达峰值，较5 ℃处理组提高20.99%；VGB处理则显著抑制SOD活性，2~24 h内（除6 h以外）均大幅低于GABA处理组，12 h降幅最大（11.91%），6 h时与GABA处理组无显著性差异。
图
12
根区5 ℃下不同处理对山定子超氧化物歧化酶活性的影响
Fig.
12
Effects of different treatments on SOD activities in Malus baccata under root-zone 5 ℃
由图13可知，5 ℃处理下，过氧化物酶（POD）活性在2~24 h内显著高于CK组，12 h达最大值，较CK组提高14.02%；GABA 处理下，在2~24 h内POD活性较5 ℃处理有进一步提高，在12 h达最大值，较5 ℃处理提高14.88%；VGB处理则显著降低POD活性，2~24 h内均低于GABA处理组，2、6 h降幅最大，分别降低29.18%、21.86%，而在2、6 h时POD活性较5 ℃处理也大幅度降低。
由图14可知，5 ℃处理下，过氧化氢酶（CAT）活性在6~24 h内显著高于CK组，12 h达到峰值，较CK组提高43.09%，而在2 h时CAT 活性与CK处理几乎相同。GABA处理可进一步提升CAT活性，2~12 h内呈持续上升趋势，6、12 h增幅最显著，分别较5 ℃处理提高12.35%、17.49%；VGB处理则显著抑制CAT活性，2~24 h内均低于GABA处理组，2、12 h降幅最大（较GABA处理分别降低31.13%、17.94%），并且与5 ℃处理无显著性差异。
图
13
根区5 ℃下不同处理对山定子过氧化物酶活性的影响
Fig.
13
Effects of different treatments on POD activities in Malus baccata under root-zone 5 ℃
图
14
根区5 ℃下不同处理对山定子过氧化氢酶活性的影响
Fig.
14
Effects of different treatments on CAT activities in Malus baccata under root-zone 5 ℃
由图15可知，5 ℃处理下，在2~24 h内APX活性较CK处理大幅度增强，分别于2、24 h达到峰值，分别较CK组提高96.26%、110.82%；GABA处理可进一步增强APX活性，12~24 h内呈上升趋势，2 h达最大值，较5 ℃处理组提高63.38%；VGB处理则显著降低APX活性，2~24 h内均低于GABA处理组，2、6 h降幅最大（分别降低36.39%、33.32%），2~12 h内与5 ℃处理组无显著性差异，24 h时显著低于5 ℃处理组。
图
15
根区5 ℃下不同处理对山定子抗坏血酸过氧化物酶活性的影响
Fig.
15
Effects of different treatments on APX activities in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.5.2 丙二醛（MDA）含量的变化
MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量高低是衡量细胞膜损伤程度的重要指标。试验结果（图16）显示，5 ℃处理下，MDA含量在2~24 h内显著高于CK组，表明亚低温胁迫加剧膜脂过氧化；GABA 处理下，MDA含量较5 ℃处理均有所降低，特别是2 h 和 12 h，下降最大，较5 ℃处理分别下降37.7%和 41.04%；但在12 h后MDA含量有所提高；VGB 处理下，在2~24 h内MDA含量较GABA处理大幅提高，特别是12 h，增幅最大，较GABA组处理提高35.04%，2、6、24 h时MDA含量显著低于5 ℃处理组但高于CK组，12 h时与5 ℃处理组无显著性差异。
图
16
根区5 ℃下不同处理对山定子丙二醛含量的影响
Fig.
16
Effects of different treatments on MDA contents in Malus baccata under root-zone 5 ℃
2.5.3 根系活力的变化
根系活力直接体现根系吸收和代谢能力，是反映根系抗逆性的主要指标。试验结果（图17）显示，5 ℃处理下，山定子根系活力在2~24 h内持续下降，24 h时较CK组降低21.39%；外源GABA处理可显著提高根系活力，2~24 h内均高于5 ℃处理组；VGB 处理下，根系活力较GABA 处理大幅下降，特别是在 12、24 h下降幅度最大，分别降低了15.72%和19.58%，24 h时根系活力达最低值。
图
17
根区5 ℃下不同处理对山定子根系活力的影响
Fig.
17
Effects of different treatments on root vitality of Malus baccata under root-zone 5 ℃
3 讨论
线粒体膜结构的完整性是保障其进行高效能量转换和物质代谢的前提（Kühlbrandt，2015）。本研究发现，5 ℃亚低温处理会导致山定子根系线粒体膜在540 nm处的吸光度显著下降，说明线粒体通透性转换孔（MPTP）开放程度增加，膜通透性升高，这与马怀宇和杨洪强（2006）对湖北海棠的研究结果一致，即低温胁迫会损伤线粒体膜结构。本研究还发现，膜通透性的增加，一方面可能是低温导致的膜脂相变和流动性下降所致，另一方面也可能与活性氧（ROS）攻击膜脂引起的过氧化反应有关，这与Schwarzländer和Fuchs（2017）的研究结果相同。与此同时，本研究结果表明，亚低温处理降低了细胞色素c/a值，提示结合于线粒体内膜的细胞色素c（Cyt c）脱落增加，这与Halestrap（2009）的研究结果相同，Cyt c是呼吸链电子传递的关键蛋白，其脱落不仅会直接破坏电子传递效率，而且还可能作为信号分子触发细胞程序性死亡。
外源GABA处理显著提高了线粒体膜吸光度和c/a值，有效维持了膜结构的完整性，减少了Cyt c的脱落，GABA的这种保护作用可能与其代谢途径密切相关。Michaeli等（2011）研究认为，GABA进入线粒体后，经GABA转氨酶（GABA-T）和琥珀酸半醛脱氢酶（succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH）催化生成琥珀酸，直接进入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环（Sil et al., 2018），这一过程不仅补充了呼吸底物，而且还可能通过维持线粒体基质中的氧化还原平衡和离子稳态（Wang et al., 2021），间接稳定了内膜结构。本研究认为，VGB作为GABA-T的不可逆抑制剂，阻断了GABA向琥珀酸的转化，其结果加剧了膜损伤，这为GABA代谢途径在膜保护中的关键作用提供了直接证据（Xie et al., 2021）。需要注意的是，GABA处理后膜吸光度和c/a值虽有显著提升，但仍未恢复至常温对照水平，这说明亚低温造成的膜损伤部分不可逆，GABA的作用在于将损伤控制在可耐受范围内。
植物应对低温胁迫的主要手段是呼吸代谢途径的优化分配。本研究发现，亚低温处理显著提高了山定子根系总呼吸速率，同时激活了CP与AP两条呼吸途径，并上调了COX和AOX基因表达。然而，Vanlerberghe（2013）和Wang等（2015）的研究结果表明，CP途径通过氧化磷酸化高效合成ATP是正常及逆境条件下的主要产能途径，AP途径虽不参与ATP合成，但可通过消耗过量还原力减少ROS积累，在逆境胁迫下发挥重要保护作用。本研究中，亚低温胁迫下AP呼吸速率及AOX基因表达量显著升高，表明植株通过激活交替呼吸途径缓解ROS对细胞的氧化损伤，这与刘慧春等（2013）对红掌的研究结果相同。本研究还发现，外源GABA处理可以调控和优化呼吸途径：一方面，外源GABA使CP呼吸速率及贡献率进一步提高，使COX基因表达上调，使产能途径更高效；另一方面，GABA显著抑制AP的呼吸速率、贡献率及AOX基因的表达，从而削弱非产能途径的能量消耗。这种调控效应使呼吸代谢向高效产能方向倾斜，为低温胁迫下细胞生理活动提供充足能量。类似地，Ning等（2022）对玉米的研究也发现，适宜浓度的SA处理能够优化呼吸途径分配，从而提高植株的抗寒性。
ATP是细胞代谢的直接能量来源，其含量变化直接反映细胞的能量供应状态。本研究结果表明，5 ℃亚低温处理可导致ATP含量和能荷水平显著下降及AMP积累增加，表明能量代谢平衡被破坏（Zhou et al., 2014）。这与刘美君等（2020）对紫花苜蓿的研究结果一致。Kerbler等（2019）研究认为，低温抑制ATP合酶活性及呼吸链复合物效率是导致能量亏缺的直接原因。然而，Sobczyk等（1985）的研究认为，AMP的积累反映了细胞能量应激状态，即当ATP消耗超过合成时，腺苷酸激酶催化ADP转化为ATP和AMP，以维持短暂的ATP供应，但AMP积累会激活AMPK信号通路，调控下游代谢适应。本研究结果还表明，外源GABA处理显著提高了ATP和ADP含量，降低了AMP积累，提升了能荷水平。这一结果直接印证了GABA支路作为“能量补给线”的功能，即GABA分解生成的琥珀酸进入TCA循环，维持了呼吸底物的供给，确保了电子传递链的持续运行和质子动力的建立，从而保障了ATP的合成效率。充足的ATP供应为细胞维持膜结合运输系统、激活防御酶蛋白合成等耗能过程提供了能量基础，最终体现为根系活力的显著提升。值得注意的是，GABA处理下ADP含量在整个处理周期内持续维持较高水平，这为ATP的快速合成提供了充足的底物储备；VGB处理则切断了GABA向TCA循环的能量补给路径，导致能量供应不足，这从侧面证实了GABA代谢途径在能量调控中的核心地位。
GABA通过增强抗氧化系统以缓解氧化损伤。本研究中，5 ℃亚低温处理下，MDA含量显著升高，膜脂过氧化现象随胁迫加深而加重；施加外源GABA能有效激活SOD、POD、CAT及APX等关键抗氧化酶，其活性均得到显著提升；同时，MDA积累量明显减少，使根系清除自由基的能力增强，从而缓解膜脂的氧化损伤。这与陈明辉等（2017）对铁皮石斛的研究结论，即SA处理能提高低温胁迫下抗氧化酶活性相类似。同时，GABA处理还显著提高了根系活力，表明其对根系整体代谢功能的保护作用。这些抗氧化效应与线粒体保护作用形成协同，共同提升山定子根系的耐低温能力。
VGB处理则为上述机制提供了关键证据。作为GABA-T的不可逆抑制剂，VGB阻断了GABA向琥珀酸的转化，切断了GABA支路与TCA循环的代谢连接。本研究结果发现，VGB处理不仅消除了GABA的保护效应，而且还加剧了胁迫损伤：线粒体膜损伤加重，CP呼吸受抑而AP呼吸也未得到有效激活，并且能量代谢进一步紊乱且抗氧化酶活性下降，这一结果具有重要的机制启示，即外源GABA的缓解作用并非通过非特异性信号分子功能来实现，而是严格依赖于其在线粒体内的分解代谢。GABA本身可能只是“前体”，真正发挥核心作用的是其代谢产物琥珀酸进入TCA循环后所引起的一系列级联效应。Che-Othman等（2020）的研究结果解释了GABA对多种胁迫均有效的原因，即无论何种胁迫，维持TCA循环通量和能量供应都是细胞存续的基本需求。
综上所述，本研究系统揭示了根区5 ℃亚低温下山定子幼苗根系线粒体的响应特征，即膜结构受损、呼吸途径应激性重构及能量代谢失衡；进而阐明了外源GABA通过保护线粒体膜完整性、优化呼吸链电子分配（促进CP途径、抑制AP途径）、维持细胞能量稳态及增强抗氧化能力，从而有效缓解胁迫损伤的整合调控机制；同时，通过VGB抑制试验证实了GABA代谢通路的完整性是其发挥保护作用的关键前提。这一多层面协同的调控网络，为深入理解GABA提高山定子根系耐寒性的生理机制提供了理论依据，也为苹果抗寒砧木的栽培调控技术开发奠定了科学基础。
4 结论
（1）亚低温胁迫会引起山定子根系线粒体膜结构损伤、呼吸代谢紊乱和能量亏缺，而外源GABA处理通过保护膜结构完整性、优化呼吸途径分配、维持能量稳态和增强抗氧化能力，可以有效缓解5 ℃亚低温对植株造成的损伤，并且这一过程依赖于GABA代谢通路的完整性。（2）外源γ-氨基丁酸（GABA）通过保护线粒体膜结构的完整性、优化呼吸链电子传递路径，从而有效缓解线粒体的功能损伤，抵御根区5 ℃亚低温；同时，GABA使根系总呼吸速率显著提高，以及细胞色素途径（CP）的活性也显著增强，进而使ATP合成效率、细胞能荷水平得以提升。这一过程通过优化能量代谢，为山定子根系应对亚低温逆境提供了充足的能量保障。(3)外源GABA对山定子根系耐低温能力的提升作用，依赖于其自身完整的代谢途径，其调控机制是一个涉及线粒体功能保护、呼吸途径优化、能量稳态维持及抗氧化系统增强的多层面协同生理过程，共同构成了防御网络以抵御亚低温胁迫。