摘要
为探究烟水处理对云南松及其变种地盘松种子萌发、胚生长及生理指标的影响，明确二者响应差异及烟水作为模拟火信号刺激林木生长发育的可行性，该研究以不同浓度的烟水进行种子处理，分析其萌发特性、胚生长状况及相关生理指标的变化。结果表明：（1）烟水处理对两种种子的萌发及生理指标均具有显著浓度效应（P<0.05），呈低促高抑趋势。（2）二者发芽指标均在0.5%浓度时达到峰值，此时云南松发芽率与发芽势较对照（蒸馏水处理）分别提高22.80%和62.54%，地盘松则分别提高12.50%和110.83%。（3）胚生长最优浓度存在物种差异，云南松下胚轴长度与胚根长度在1%浓度时最大（较对照提高31.96%和67.89%），地盘松则在0.25%浓度时最佳（较对照提高18.18%和60.77%）。（4）低浓度烟水还可增强α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的活性，提高可溶性糖和可溶性蛋白的含量，降低丙二醛含量，改善种子代谢和抗氧化能力。（5）云南松种子对烟水的敏感性高于地盘松种子。综上所述，低浓度的烟水可通过增强贮藏物质转化并调控抗氧化系统促进萌发与胚生长，可作为安全可控的模拟火信号应用于苗木培育。
Abstract
This study aimed to explore the effects of smoke water treatment on seed germination, embryo growth, and physiological indices of Pinus yunnanensis and its variety P. yunnanensis var. pygmaea, and to clarify their response differences and the feasibility of using smoke water as a fire signal mimic to stimulate tree growth and development. Seeds of two pines were treated with smoke water of different concentrations, and changes in their germination characteristics, embryo growth status, and related physiological indices were analyzed. The results were as follows: (1) The germination and physiological indices of two species seeds were significantly affected by the concentration of smoke water (P<0.05), showing a trend of promotion at low concentrations and inhibition at high concentrations. (2) The germination indices of two species peaked at 0.5%, at which the germination rate and germination energy of P. yunnanensis increased by 22.80% and 62.54%, respectively, while those of P. yunnanensis var. pygmaea increased by 12.50% and 110.83%, compared with control (distilled water treatment). (3) Two species differed in the optimal smoke water concentration for embryo growth. The longest hypocotyl and radicle of P. yunnanensis were observed at 1% (increased by 31.96% and 67.89%, respectively, compared with control), while those of P. yunnanensis var. pygmaea were observed at 0.25% (increased by 18.18% and 60.77%, respectively, compared with control). (4) At low concentrations, the smoke water enhanced the activities of α-amylase, protease, and lipase, increased soluble sugar and soluble protein contents, and reduced malondialdehyde content, thereby improving seed metabolism and antioxidant capacity. (5) P. yunnanensis seeds showed higher sensitivity to smoke water than P. yunnanensis var. pygmaea seeds. In conclusion, the smoke water promotes seed germination and embryo growth at low concentration by enhancing the mobilization of storage substances and regulating the antioxidant system, and thus can be applied as a safe and controllable fire signal mimic for seedling cultivation.
林火作为生态系统的一个重要因子，对森林系统并非完全有害；相反，很多植物的更新与火因子有关（谷会岩等，2017）。在林火频发区域，火后产生的高温及释放的烟雾被认为是驱动种子萌发的核心要素，二者通过物理与化学两种机制调控种子的休眠解除及后续萌发进程（Moreira et al., 2010）。高温可使种鳞开裂和种皮破裂，促使密封于球果中的种子落地并提升其透水性，加速种子吸胀，在林业生产中，高温处理较难实现，且存在安全隐患（Auld & O'Connell, 2010）。烟水作为一种可量化、易操控的模拟材料，已成为火因子领域（尤其是烟雾效应）的重要研究载体。烟水作用于植物时呈现出类似激素的浓度效应，即低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用，这已在稗（Echinochloa crus-galli）、番茄（Solanum lycopersicum）、莴苣（Lactuca sativa）等多种植物中得到证实（Calabrese & Agathokleous, 2021）。在生理方面，烟水中的活性物质（如氮氧化物、karrikinolide等）能增强种皮半透膜的渗透性，调节赤霉素（gibberellin，GA）与脱落酸（abscisic acid，ABA）的含量，进一步提升水解酶活性，促进贮藏物质分解与转化，为种子萌发提供充足的物质与能量。例如：莴苣种子经烟水处理后ABA含量降低，酶活性显著增强，并伴随着种子萌发率增加（Gupta et al., 2019）；烟水增强GA的信号通路，增强淀粉动员效率，有效促进豆类和玉米（Zea mays）的种子萌发及幼苗生长（Sunmonu et al., 2016）。
云南松（Pinus yunnanensis）属于高大乔木，是中国西南地区重要的用材树种，其不仅在水土保持和荒山造林中发挥着关键作用，还具有显著的经济价值，其变种地盘松（P. yunnanensis var. pygmaea），虽呈灌丛状，但抗性强，在困难立地造林中发挥重要作用（廖声熙，2008；邓喜庆等，2013）。然而，1~3年的云南松、地盘松生长缓慢，呈现“蹲苗”现象，这不仅导致种群自然更新受阻，还致使造林成活率与保存率偏低，人工更新困难（李莲芳等，2009）。云南松、地盘松的主要分布区域是我国林火高发区。在长期适应火干扰的过程中，它们演化出一系列独特的生存策略，如球果延迟开放，树皮厚，高温促进种子萌发，蹲苗和火后幼苗加速生长等，以维持其在易火生境中的种群延续，并形成一定的火依赖性（Su et al., 2015；司宏敏等，2019；龙左卿等，2021；苏文华等，2023）。
人为管理的加强使林火发生频率大幅下降，这可能对火依赖型的云南松和地盘松的生态适应和更新产生影响。目前，针对云南松、地盘松与火相关特性的研究多集中于高温方面，对烟雾（烟水）的研究尚属空白。本研究通过不同浓度烟水处理云南松和地盘松的种子，旨在解析烟水对其萌发特性及生理调控的作用机制，明确二者对烟水的响应差异，并评估烟水作为火模拟信号刺激火依赖型树种生长发育的可行性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
云南松和地盘松的球果采自云南省昆明市东川区，稻草购于昆明市。
1.2 试验方法
烟水的制作参考Gupta等（2020）的方法：使用50 g干稻草燃烧产生的烟雾通入250 mL的蒸馏水中，将得到的溶液进行过滤得到烟水原液。
将烟水原液按比例稀释至原液浓度的0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%，以蒸馏水（0%）为对照，共设置7个烟水浓度的处理；云南松和地盘松种子经0.5%高锰酸钾溶液消毒30 min后，使用蒸馏水将其冲洗干净，用滤纸吸干种子表面水分，分别在不同浓度烟水中黑暗浸泡24 h，去除漂浮于液面的瘪粒后播种于垫有滤纸的直径12.5 cm的培养皿中，每皿播种25粒。云南松、地盘松每个处理各播21皿（其中18皿用来测量种子的生理生化指标，3皿用来测定种子发芽率、下胚轴长度及胚根长度），每皿初始添加5 mL对应浓度烟水溶液，之后每7 d换一次滤纸，更换滤纸后，所有处理均添加5 mL的蒸馏水，培育期间保持滤纸湿润，在25 ℃的恒温培养箱中遮光培育。
1.3 指标测定
每日统计发芽种子数（以胚突破种皮≥2 mm为萌发标准），日发芽数达到最高峰时开始测定发芽势（云南松和地盘松种子的发芽数均在第7天达到最大），试验于第21天终止，终止标准为连续3天发芽率不超过1%，此时统计发芽率，并使用游标卡尺（精度为0.01 mm）对下胚轴长度和胚根长度进行测定。
种子开始露白时，随机选取云南松和地盘松的种子各10粒，剥离种壳进行生理指标测定（播种第4天测定）。采用H2SO4-苯酚比色法测定可溶性糖含量和淀粉的含量；采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量；采用3,5-二硝基水杨酸法测定α-淀粉酶活性（李合生，2000）；采用Folin-酚法测定蛋白酶活性（穆赢通等，2024）；采用酸碱滴定法测定脂肪酶活性（高奇等，2011）。
发芽率（%）=（发芽种子总数/供试种子总数）×100；
发芽势（%）=（日发芽数达到峰值时发芽种子总数/供试种子总数）×100。
1.4 数据分析
采用SPSS 26进行单因素方差分析；采用邓肯（Duncan）多重比较分析进行显著性差异检验。
2 结果与分析
2.1 烟水浓度对种子萌发的影响
烟水处理对云南松和地盘松种子的萌发具有显著的浓度效应（P<0.05）。在0.5%烟水溶液下，两类种子的发芽率及发芽势均达到峰值，且均显著高于对照（P<0.05），此浓度下，云南松发芽率和发芽势较对照分别提高22.80%和62.54%，地盘松发芽率和发芽势较对照分别提升12.50%和110.83%（图1：A、B）。当浓度增至4%时，云南松发芽率大幅降低，8%烟水溶液较对照表现出抑制作用；地盘松在8%烟水溶液下发芽率虽略高于对照，但差异不显著（P>0.05）。在0~2%浓度范围内，云南松和地盘松的发芽势响应模式相似；当浓度升至4%时，云南松的降幅大于地盘松；至8%时，二者发芽势相同。
2.2 烟水浓度对云南松、地盘松下胚轴长度及胚根生长的影响
由图2可知，胚生长的最优浓度存在物种差异：云南松下胚轴长度和胚根长度在1%浓度时达最大值，且显著高于对照（P<0.05），较对照分别提高31.96%、67.89%，地盘松下胚轴和胚根长度则在0.25%浓度时最优，较对照分别提高18.18%、60.77%。与云南松相比，地盘松胚的生长受烟水浓度影响幅度较小，整体变化趋势较为平缓。其中，地盘松下胚轴长度除0.25%处理组外，其他浓度处理组间无显著差异（P>0.05），胚根长各处理组间均无显著差异（P>0.05）。
2.3 烟水浓度对云南松、地盘松种子酶活性的影响
烟水处理对两种种子内α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性具有显著的浓度效应（P<0.05）。云南松、地盘松种子的α-淀粉酶活性均在烟水浓度为0.25%时达到最大值（图3：A），蛋白酶活性均在烟水浓度为0.5%时达到最大值（图3：B），脂肪酶活性分别在1%（云南松）和0.25%（地盘松）烟水溶液时达到最大值（图3：C），且均显著高于对照组（P<0.05）。达到峰值时，云南松和地盘松的α-淀粉酶活性较对照分别提高11.00%、10.93%，蛋白酶活性较对照分别提高113.09%、124.67%，脂肪酶活性较对照分别提高40.42%、18.27%。高浓度的烟水对酶活性产生抑制：云南松和地盘松α-淀粉酶活性分别在2%和1%浓度时开始低于对照，到4%浓度时均显著低于对照（P<0.05，图3：A）；二者蛋白酶和脂肪酶活性均自2%浓度起急剧下降，至8%浓度时，蛋白酶活性均与对照无显著差异（P>0.05），脂肪酶活性则均显著低于对照（P<0.05，图3：B、C）。
图
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烟水浓度对云南松、地盘松种子发芽率（A）和发芽势（B）的影响
Fig.
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Effects of smoke water concentration on germination rate (A) and germination energy (B) in seeds of Pinus yunnanensis and P. yunnanensis var. pygmaea
图
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烟水浓度对云南松、地盘松下胚轴长度（A）及胚根长度（B）的影响
Fig.
2
Effects of smoke water concentration on hypocotyl length (A) and radicle length (B) of Pinus yunnanensis and P. yunnanensis var. pygmaea
2.4 烟水浓度对可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响
烟水处理对两种种子可溶性蛋白、可溶性糖含量具有显著的浓度效应（P<0.05）。云南松、地盘松种子可溶性蛋白含量均在烟水浓度为0.5%时达到最大，较对照分别提高14.84%、15.32%，且均显著高于对照（P<0.05，图4：A）；云南松、地盘松种子可溶性糖含量分别在烟水浓度为0.5%和0.25%时达到最大，相较于对照分别提高38.14%、36.10%，均显著高于对照（P<0.05，图4：B）。云南松、地盘松种子可溶性蛋白含量分别在1%和4%烟水浓度时开始大幅下降，到烟水浓度为8%时，两类种子内的可溶性蛋白含量与对照组均没有显著差异（P>0.05）；云南松可溶性糖含量自4%浓度起大幅下降，但8%浓度时仍显著高于对照（P<0.05），而地盘松可溶性糖含量在0.5%浓度后急剧降低，1%浓度时已与对照无显著差异（P>0.05），后续浓度处理间波动平缓。
图
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烟水浓度对云南松、地盘松种子α-淀粉酶（A）、蛋白酶（B）、脂肪酶（C）活性的影响
Fig.
3
Effects of smoke water concentration on activities of α-amylase (A), protease (B), and lipase (C) in seeds of Pinus yunnanensis and P. yunnanensis var. pygmaea
2.5 烟水浓度对丙二醛含量的影响
烟水处理对两种种子丙二醛含量表现出显著的浓度效应（P<0.05）。当烟水浓度为1%时，云南松、地盘松种子的丙二醛含量最低，较对照组分别下降36.84%、15.69%，且均显著低于对照组（P<0.05，图5）；随着烟水浓度的升高，二者丙二醛含量均呈现回升趋势，云南松种子的丙二醛含量在烟水浓度为2%时开始大幅回升，而地盘松在4%时大幅回升，且两类种子的丙二醛含量在烟水浓度为4%和8%时与对照均无显著差异（P>0.05）。
3 讨论
种子萌发需消耗大量物质和能量，其来源主要依赖脂肪、蛋白质和淀粉等贮藏物质的分解，因此水解酶（脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶）活性与萌发状况密切相关（王艾平和徐芬芬，2016）。具体而言，淀粉酶催化胚乳、糊粉层中的淀粉分解为可溶性糖（Zeeman et al., 2010），脂肪酶则将脂肪水解为甘油、脂肪酸，并进一步转化为糖类，二者作用使种子内可溶性糖含量提升，从而为其提供更多的能量及碳源（袁伟伟等，2010）。同时，蛋白酶活性增强促使蛋白质降解为小分子肽和氨基酸，为萌发提供氮源（张美月等，2022）。然而，水解酶受GA与ABA的调控：GA能够诱导水解酶基因表达，增强酶活性，从而加速胚乳中贮藏物质分解（Rehman et al., 2018; 宋松泉等，2024）；ABA则通过拮抗GA信号通路，抑制水解酶合成（Vishal & Kumar, 2018）。适宜浓度的烟水则可抑制ABA的合成与信号传递，同时激活并增强GA信号通路，从而提高水解酶的活性，动员贮藏物质的分解，为种子萌发提供充足的物质与能量（Khatoon et al., 2020）。本研究发现，低浓度烟水处理显著提高了种子内α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性，并伴随着可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加，而高浓度烟水处理的提升效果不明显，甚至出现抑制作用，这表明低浓度烟水处理促进了种子贮藏物质的分解与转化，且符合烟水的浓度效应，这与烟水促进莴苣（Gupta et al., 2019）和水稻（Jamil et al., 2020）种子萌发的研究结果相似。本研究观察到的水解酶活性增强现象，其内在机制可能与烟水调节GA与ABA的含量有关。此外，低浓度烟水处理下，云南松、地盘松种子内的丙二醛含量均有所降低，该物质作为膜脂过氧化的终产物，其含量降低表明细胞膜损伤减轻（王宇超等，2010），说明低浓度烟水对种子抗氧化系统具有调节作用，这与烟水改善小麦（Triticum aestivum）盐胁迫下抗氧化酶活性的机制相似（Shabir et al., 2022）。综上所述，低浓度的烟水可能通过调节云南松、地盘松种子的代谢水平（物质和能量分解与合成）及抗氧化系统活性，共同促进种子萌发。
图
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烟水浓度对云南松、地盘松种子可溶性蛋白（A）、可溶性糖（B）含量的影响
Fig.
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Effects of smoke water concentration on contents of soluble protein (A) and soluble sugar (B) in seeds of Pinus yunnanensis and P. yunnanensis var. pygmaea
图
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烟水浓度对云南松、地盘松种子丙二醛含量的影响
Fig.
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Effects of smoke water concentration on malondialdehyde content in seeds of Pinus yunnanensis and P. yunnanensis var. pygmaea
云南松更新过程中，蹲苗是制约其成活率的一个重要因素。本研究发现，低浓度烟水处理显著促进了下胚轴和胚根的生长，其中云南松在1%烟水溶液处理下，下胚轴长度和胚根长度分别较对照提高31.96%和67.89%，地盘松在0.25%烟水溶液处理下分别提高18.18%和60.77%。这与施用吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和吲哚丁酸（IBA）等生长调节剂，从而加速云南松幼苗生长，进而缩短蹲苗期作用效果相似（郑书绿等，2015）。野外调查数据显示，自然状态下，云南松发芽后第2年和第3年的株高年平均生长量分别为0.4~3.2 cm和0.7~3.0 cm（王文俊等，2017）；而经林冠火后云南松的幼苗在第2年和第3年的株高增长量平均为6.53 cm和7.77 cm，经地表火后针叶变黄脱落地段的云南松幼苗株高增长量平均为6.91 cm和4.60 cm（司宏敏等，2019）。这表明火干扰后云南松蹲苗现象得到明显改善，进一步印证了烟可能是火后云南松加速生长的重要刺激因子。生产中直接利用计划燃烧刺激林木生长的风险高、管控难，喷施生长调节剂则成本较高，而烟水易于获取、成本低廉，以其模拟火后烟雾效应刺激林木生长发育较计划燃烧安全性更高、可操作性更强，具有很好的应用潜力。
从物种差异来看，云南松与地盘松种子对烟水的敏感性不同，地盘松种子的发芽、生长、生理各项指标相较于云南松而言波动幅度更小，特别是对高浓度烟水，地盘松表现出更低的敏感性，这可能与云南松、地盘松在更新方式、对火的策略及生长环境上的差异有关。云南松作为高大乔木，以实生苗为主进行更新，其所在群落多发生地表火，松针具有点火时间短、燃烧时间长和释放热量低的特点，属于“快速燃烧对策”，且球果延迟开放程度较低，地表火产生的烟雾向上扩散，可直接刺激树冠及树冠中尚存于开放球果中的种子（孟丽媛，2018；周绍齐，2022）。地盘松属于灌木，可以通过种子及萌蘖的方式进行更新，其群落以林冠火为主，松针点火及燃烧时间长、释放热量高，属于“高热量燃烧对策”，球果延迟开放程度远高于云南松，且种子能够承受更高温度，林冠火产生的热量能有效促使球果开裂并释放种子（张辉红等，2018；王兵等，2020），即使种子在火灾中失活，其地下萌蘖能力也能实现火后快速再生，相较于云南松而言，它对温度表现出更强的响应。此外，地盘松生存于海拔更高、温度更低、降水更少、干扰更强的严苛环境（陈剑等，2021）。综上所述，地盘松可能在更新策略、燃烧特性、环境适应的协同作用下降低了对烟化学信号的敏感性。
4 结论
烟水处理对云南松和地盘松种子萌发、生长及各项生理指标均具有显著浓度效应。低浓度烟水（0.25%~1%）通过增强水解酶（α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶）活性、促进贮藏物质（淀粉、脂肪、蛋白质）分解为可供种子直接利用的可溶性糖、氨基酸等代谢产物，并减轻膜脂过氧化损伤（丙二醛含量降低），协同促进种子萌发与胚生长。其中，云南松、地盘松种子发芽指标在烟水浓度为0.5%时达到最大，云南松、地盘松分别在1%和0.25%烟水溶液时胚生长最优；云南松对烟水的敏感性高于地盘松。本研究虽证实烟水对云南松、地盘松种子萌发及生长具有促进作用，为二者苗木培育提供了一种安全、可控的火信号模拟技术，但仍需苗圃及田间试验进行验证，并且烟水调控的深层机制仍有待研究。