Page 93 - 《广西植物》2021年第4期
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࿗ 期                 韦莉等᧥ 花生类受体蛋白激酶基因 ዛ၊ଧዛᣞϟ 的克隆及原核表达                                       ጢ Ꭾ ጢ
            ዶၤାዶ᣽ϟ 的胞内域纯化蛋白ᖔ为发掘 ዛ၊ଧዛᣞϟ 在花                      ༁ᔀʢ׹ᔽዹᔀ༁ᣰ ఋᥘ̀ᥘᥘᣰ ɯ 和   ۪ʢᆍᡷ୩ዹᑕ᤟ᔀ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ औᔀᤦ঎

            生铝处理下的调控机制奠定基础ᤥ                                    ᔀ଴ᡱᑕ༁ᢃ঎ᆍʢ੫ ᣰ ᡱʢᆍᡷ༁ዹᑕ᤟ᔀ ᣰ ɯ 分别预测蛋白的跨膜结构和
                                                               疏水 性ଫ 利用 ୩ᔽ੫Ⴟᑕ᤟࿗঎ ϟ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ዹᤦ༁঎ʛᡷࣼ঎ʛҴ ᣰ
            ϟজ 材料与方法                                           ༁ᔀʢ׹ᔽዹᔀ༁ᣰ ୩ᔽ੫Ⴟᑕ᤟۪ ᣰ ɯ在线预测蛋白的信号肽有无ᖔ利

                                                               用 ۪୩ᨃ኏ఋ ᧧᧧ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ औᆍ᤟஦ᡱ༁ᆍʢᡷ঎ၤ੫ዹ঎ᢼᡱ ᣰ ɯ 对 ዶၤାዶ᣽ϟ
            ϓॹϓ 材料                                             进行 了亚细胞定位分析ᖔ ୩ᨃ۪ᥘዶ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ Ⴟᡱ༁ᑕ᥋
            ϟ঎ϟ঎ϟ 植物ܓ菌株和载体জ 供试材料是实验室早期                         ᡱʢᑕᤦᔽ঎ᔽᤦዹᡱ঎஦ʢᣰ ዹ੫ᔽ᥋ᤦᔽႿᣰ Ⴟᡱ༁ᑕᡸᑕࣼᡷᆍቝᑕᡷ঎ᡱ᤟ᥳ ᡱᑕ੫ᔀ ᢉ ᣰશ۪୩ዶᣰ
            筛选得到并保存的铝敏感花生品种ጸ 中花 ԰ 号ᆥ                           Ⴟᡱ༁ᑕ ༁ᆍᡱቝᑕ঎ၤᡷቝ᤟ɯ在线预测蛋白质的二级结构ᖔ利用
            ྉጸԻ̀԰ᆥɯ和铝耐受性花生品种ጸँँͱϟጢԡᎮᆥᤥ 菌株                      ୩ۼ᧧୩୩᥋ᥘᨃጶᓂ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ ༁औᔽ༁༁ቝᆍʛᔀ᤟঎ ᔀ଴ᡱᑕ༁ᢃ঎ ᆍʢ੫ᣰ ɯ
            ጛ໧ዞ၊ᓣʗᔠዞ၊ᔠᐹ ዞᅳᤀᔠ ᧕̀ጢምᖔ኏ᆍ༁ᔀᡷᡷᑕ 为实验室以甘油管形            在线软件预测获得 ዶၤାዶ᣽ϟ 蛋白三级结构ᖔ利用
            式于ͱऐԡ ቩ 保存ᖔ感受态细胞自行制备保存ଫ原核                          ᥘጶ᥈ዶጢ঎ԡ 软件进行多序列比对构建系统进化树ଫ利
            表达载 体 ᡱᤩጛᣏ᤬ᤃᡓ᤬ϟ 为本实验室保存ᖔᡱ᤹ᦵϟँ᤬௴                    用 શऊା᧧᥋ାᓂዶ୩ఋ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ ᤦ᤟ᑕ༁ᡷ঎ Ⴟዹᤦᔽ঎ Ⴟ᤟ቝ঎ Ⴟᔽၤ঎ ੫ᆍ׹ᣰ

            载体购自宝生物工程ྉ大连ɯ有限公司ᤥ                                 ା᤟ᑕ༁ᡷ঎ዹ੫ᔽɯ进行 ዶၤାዶ᣽ϟ 蛋白激酶域的分析ᤥ
            ϟ঎ ϟ঎ ԰ 酶和试剂 জ      ኏  ఋ  ᥋  ۪  ऊ  ኏  反转录酶均 购 自        本文中提到的基因或蛋白质的序列信息可在
            ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕ 公司ଫఋା ᥈ʢᔀᔀႿ ۪ʢᔀቝᔽ଴ ጶ଴ ఋᑕी ᧧᧧ᖔʛશఋ۪ܦ限        拟南芥数据库ྉዶʢᑕᤦᔽʛᆍᡱ༁ᔽ༁ ᧧Ⴟ஦ᆍʢቝᑕᡷᔽᆍႿ ኏ᔀ༁ᆍࣼʢዹᔀɯ或
            制性内切酶 ጛዞᅳ኏ሙ和 ᣏ၊ᅳሙ购自宝生物工程ྉ 大                        基因数据库ྉ᥈ᔀႿାᑕႿҴ ᣰ ጶᥘାᓂɯ 中利用如下登记号
            连ɯ有限公司ଫ高保真酶ܦ非连接酶依赖型单片段                             找到᧥ዛ၊ଧዛᣞϟ ྉ ᣮᥘ ᡸԡ԰ጢᎮऐሕᎮऐᤃ঎ ϟɯᖔ ዛᡙଧዛᣞϟྉ શᥘ ᡸ
            快速克隆试剂盒ྉ ऊ᤟ᆍႿጶ଴ᡱʢᔀ༁༁ ֒ ᨃႿᔀ ୩ᡷᔀᡱ ऊ᤟ᆍႿᔽႿ੫            ԡԡϟ԰ԡሕँᎮጢ ɯᖔ ଧʗᒦቴቴᧇᧇጢ ྉ ȮᣮԡᎮሕԡऐᤃ ɯᖔ ᤩ၊ଧዛᣞϟ
            ᣽ᔽᡷɯ购自南京诺唯赞生物科技有限公司ଫ抗 ᥈୩ఋ                          ྉશᥘᡸԡԡϟሕ԰ᤃऐᤃᤃɯᖔ ᒦᢝଧዛᣞϟ ྉ ᣽ɟϟሕϟँऐԡɯᖔટᐹଧዛᣞϟ
            标签鼠单克隆抗体ܦ山羊抗小鼠 ᧧੫᥈ྉ̀շᓂɯ 购自康                        ྉᣮᥘᡸԡϟँሕᎮᎮԡᤃᤃɯᖔ ᧣໧ଧዛᣞϟྉ᣽ఋᤃᤃँᤃँԡɯᤥ
            为世纪生物科技有限公司ଫ还原型谷腕甘肽购自                              ϟ঎԰঎࿗ ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因在 ዶ᤟ 处理下的表达特性জ 以
            生工生物工程有限公司ܦ氨苄霉素ܦ氯霉素购自北                             Іଧͅϟԡቴ 为内标基因ᖔ用实时荧光定量 ۪ऊ኏ 分析
            京 ୩ᆍ᤟ᑕʢᤦᔽᆍ 公司ଫ蛋白纯化的亲和层析材料购自                        ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因在不同 ዶ᤟ 处理时间ྉ ԡܦ࿗ܦऐܦϟ԰ܦ԰࿗

            ᥈ጶ ̀ᔀᑕ᤟ᡷၤዹᑕʢᔀ 公司ଫ᧕શዶ 纯化回收试剂盒ܦ质粒小                   ၤɯ下的相对表达水平ᖔ前期材料培养参考詹洁等
            提试剂盒购自天根生化试剂公司ᤥ                                    ྉ԰ԡԡऐɯ 的方法ᖔ略有改动ଫ反应体系及程序参考
            ϓॹԣ 实验方法                                           ఋା ᥈ʢᔀᔀႿ ۪ʢᔀቝᔽ଴ ጶ଴ ఋᑕी ᧧᧧ 产品说明ᖔ实验做 ሕ 次
            ϟ঎԰঎ϟ 花生总 ኏શዶ 的提取和 ዹ᧕શዶ 第一链的合成                     生物学重复ᖔ检测引物于 શऊା᧧᥋۪ʢᔽቝᔀʢ ାᓂዶ୩ఋ 设
            জ኏શዶ 提取及 ዹ᧕શዶ 的合成参照 ᓂᔽࣼ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ྉ԰ԡϟԡɯ               计ᖔ序列如表 ϟ 所示ᤥ

            的方法进行ᤥ                                             ϟ঎԰঎ጢ ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因原核表达载体构建জ 为获得
            ϟ঎԰঎԰ ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因克隆জ 以ጸԻ̀԰ᆥ ዹ᧕શዶ 为模板ᖔ                ᥈୩ఋ᥋ዛ၊ଧዛᣞϟ᥋ऊ᧕ 融合基因ᖔ 以 ጸԻ̀԰ᆥ ዹ᧕શዶ 为模
            参照 ఋᑕҴᑕʢᑕ ᓂዶ 酶说明书设置 ۪ऊ኏ 体系和程序ᖔ以                    板ᖔ用引物 ዶၤାዶ᣽ϟ᥋ऊ᧕᥋ጛዞᅳ኏ ᧧᥋èྉऊऊऊऊఋ᥈᥈᥈ዶఋऊ

            下 列引物 ዛ၊ଧዛᣞϟ᥋è᧥ ዶఋ᥈ዶ᥈ዶዶఋ᥈ዶ᥈᥈ఋఋऊఋఋఋఋ᥈               ऊऊऊ᥈᥈ዶዶఋఋऊऊ᥈ዶዶ᥈ዶዶ᥈᥈ዶዶዶऊ᥈ఋ᥈ऊఋ᥈ዶఋఋ ɯ 和
            ዛ၊ଧዛᣞϟ᥋኏᧥ ఋऊఋዶ᥈᥈ዶऊऊዶ᥈ዶ᥈ዶ᥈ఋఋऊዶఋऊ 扩增目的               ዶၤାዶ᣽ϟ᥋ऊ᧕᥋ᣏ၊ᅳ ᧧᥋኏ྉ᥈ఋऊዶऊ᥈ዶఋ᥈ऊ᥈᥈ऊऊ᥈ऊఋऊ᥈ዶ᥈
            片段ᖔ挑选含目的片段的菌液进行测序验证ᖔ并将测                            ఋऊఋዶ᥈᥈ዶऊऊዶ᥈ዶ᥈ዶ᥈ఋఋऊዶఋऊఋ᥈ऊఋɯ扩增目的片段ᖔ
            序验证结果正确的菌液保存于ͱऐԡ ቩᤥ                                将 ۪ऊ኏ 产物纯化回收ᖔ 参照 ऊ᤟ᆍႿጶ଴ᡱʢᔀ༁༁ ֒ ᨃႿᔀ
            ϟ঎԰঎ሕ ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因的生物信息学分析জ 在克隆得到                     ୩ᡷᔀᡱ ऊ᤟ᆍႿᔽႿ੫ ᣽ᔽᡷ 试剂盒方法进行回收产物与酶切
            ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因完整开放阅读框的前提下ᖔ利用在线                          载体重组反应ᖔ热激法转化重组产物至 ᧕̀ጢም 感
            软件 ጶ଴۪ዶ୩ɟ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ औᔀᤦ঎ ᔀ଴ᡱᑕ༁ᢃ঎ ᆍʢ੫ ᣰ ዹᆍቝᡱࣼᡷᔀ ᡸ  受态ᖔ挑选阳性克隆进行测序验证ᖔ将测序正确的
            ᡱᔽᣰ ɯ对 ዶၤାዶ᣽ϟ 蛋白进行蛋白分子量及等电点的预                      阳性克隆体质粒转化至表达菌株 ኏ᆍ༁ᔀᡷᡷᑕᖔ并以甘

            测ଫ 通过 ఋᥘ̀ᥘᥘ԰঎ ԡ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ ዹᤦ༁঎ ʛᡷࣼ঎ ʛҴ ᣰ     油管的形式保存于ͱऐԡ ቩ 冰箱ᤥ
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