Page 80 - 《广西植物》2022年第9期

ϟ ጢ ϟ ᤃ 广জ 西জ 植জ 物
ဂቝᖔ瑞士 ዶቝᔀʢ༁ၤᑕቝ ۪ၤᑕʢቝᑕዹᔽᑕ ାᔽᆍᡷᔀዹၤ ዶା 公司ɯଫ
柱层析硅胶ྉ԰ԡԡ ጲ ሕԡԡ 目和 ሕԡԡ ጲ ࿗ԡԡ 目ɯᖔ硅胶
̀ྉϟԡ ጲ ࿗ԡ ဂቝɯ 和薄层层析硅胶 ᥈è԰ጢ࿗ྉԡ঎԰ԡ ጲ
ԡ঎԰ጢ ቝቝɯྉ青岛海洋化工厂ɯᤥ
ϓॹԣ 仪器
୩ᔽቝ᥋۪̀ᓂऊ 半制备色谱仪ྉۼᑕ༁ᡷᔀʢ༁ᖔ ᧕ᔀ᤟ᡷᑕ ᤃԡԡɯଫ
酶标仪ྉఋၤᔀʢቝ ༁ዹᔽᔀႿᡷᔽ஦ᔽዹᖔ ჆ዶ኏᧧ᨃ୩᣽ዶશᓂВᣮɯଫ显微镜
ྉᓂᔀᔽዹᑕᖔ ᧕ቝᔽऐɯଫ流式细胞仪ྉዶऊጶዶା᧧ᨃᖔ શᆍ׹ᆍዹᢃᡷᔀɯଫ
ጶ୩᧧᥋ᥘ୩ 电喷雾质谱仪 ྉ 布鲁克道尔顿公司ɯଫᤃԡԡ
ᥘ̀झ 型超导核磁共振仪ྉ瑞士 ାʢࣼҴᔀʢ 公司ɯᤥ
԰জ 研究方法
ԣॹϓ 提取分离
称取雷公藤药材 ԰ԡ Ҵ੫ᖔ用 ँጢᠮ乙醇回流提取
ሕ 次ᖔ每次 ሕၤᤥ 收集提取液浓缩至原体积的 ϟᣰ ሕᖔ
少量多次加水ᖔ浓缩至无醇味ᤥ 乙酸乙酯萃取至
无颜色ᖔ浓缩旋干萃取液ᖔ取适量溶剂溶解ᖔ中性
氧化铝拌样ᖔ洗脱剂为乙酸乙酯过中性氧化铝层
析柱ྉϟԡԡ ጲ ԰ԡԡ 目ɯᖔ浓缩回收溶剂得到雷公藤多
苷粗品 ϟԡ࿗ ੫ᤥ
雷公藤多苷粗品用 ࿗ԡ ጲ ऐԡ 目硅胶拌样ᖔ使其
均匀吸附于硅胶上ᖔϟԡ 倍量的硅胶柱层析ྉ԰ԡԡ ጲ
ሕԡԡ 目ɯ 粗分段ᖔ 以不同体积比的氯仿 ᨒ 甲醇
ྉᎮԡ ᨒ ϟ ጲ ϟ ᨒ ϟɯ 进行梯度洗脱ᤥ 通过薄层层析
ྉఋᓂऊɯ跟踪观察组分在紫外分析仪下的荧光及显
色情况ᖔ合并相似部分ᖔ共分为 ᤃ 段ᖔ标记为 èʢ঎ϟ
ྉ࿗ԡԡ ቝ੫ɯܦèʢ঎԰ྉ԰঎ጢ ੫ɯܦèʢ঎ሕྉ࿗ԡ ੫ɯܦ èʢ঎࿗ྉ԰ԡ ੫ɯܦ
èʢ঎ጢྉ࿗ԡ ੫ɯ和 èʢ঎ᤃྉ࿗঎ϟ ੫ɯᤥ 将 èʢ঎ጢ 段先通过 ᥘऊ᧧
柱ᖔ用不同体积比的甲醇 ᨒ 水混合溶剂进行梯度
洗脱ᖔ洗脱比例为 ጢԡ ᨒ ϟܦᎮԡ ᨒ ϟܦँԡ ᨒ ϟԡܦϟԡԡ ᨒ ԡᤥ
使用 ఋᓂऊ 跟踪观察组分在紫外分析仪下的荧光及
显色 情 况ᖔ 合并相似部分ᖔ 标记为 èʢ঎ጢ঎ϟྉ ԰ԡԡ
ቝ੫ɯܦèʢ঎ጢ঎԰ྉϟ঎ጢ ੫ɯܦèʢ঎ጢ঎ሕྉϟ԰঎ँ ੫ɯܦèʢ঎ጢ঎࿗ྉ԰ϟ঎Ꭾ
੫ɯᤥ 将 èʢ঎ጢ঎ϟ 段经葡聚糖凝胶柱层析及反复重结
晶得到化合物 ϓԣྉऐ ቝ੫ɯᤥ 将 èʢ঎ጢ঎࿗ 经半制备分离
技术得到化合物 ᎒ྉऐ ቝ੫ɯܦࣽྉᤃ ቝ੫ɯܦ࣮ྉϟ԰ ቝ੫ɯܦϓԔ
ྉँ ቝ੫ɯ 和 ϓϓྉϟጢ ቝ੫ɯᤥ 将 èʢ঎ϟ 经反复重结晶ܦ正
反相硅胶柱层析得到化合物 ᇺྉऐऐ ቝ੫ɯᤥ 将 èʢ঎԰
经 ᥘऊ᧧ 柱层析ܦ葡聚糖凝胶柱层析及半制备高效
液相色谱等分离手段得到化合物 ϓྉሕ԰ ቝ੫ɯܦԣྉ԰ጢ
ቝ੫ɯᤥ 将 èʢ঎࿗ 经葡聚糖凝胶粗分段后过半制备得
到化合物 ྽ྉँ ቝ੫ɯܦጇྉϟጢ ቝ੫ɯ和 ᣤྉϟ԰ ቝ੫ɯᤥ
࿗԰ 卷
ԣॹԣ 生物活性测试
԰঎԰঎ϟ 用 ᥘఋఋ 法筛选化合物活性জ 收集对数生长
期的 ୩̀᥋୩ɟጢɟ 细胞ܦ᣽ጢᤃ԰ 细胞ܦ̀ᔀ᤟ 细胞ᖔ重悬得
到细胞悬液并进行细胞计数ᖔ按照每孔 ँԡ ဂᓂ 的
体积将细胞接种于 ँᤃ 孔板中ᖔ在 ጢᠮ ऊᨃ ܦሕᎮ ቩ 条
԰
件下的细胞培养箱中培养过夜待其细胞贴壁后ᖔ
加入 ϟԡ ဂᓂ 含药培养基ᖔ使得药物终浓度为 ϟԡԡܦ
ጢԡܦ԰ԡܦϟԡܦጢܦ԰঎ጢ ဂቝᆍ᤟ኼᓂ ᖔ每个浓度 ሕ 个复孔ᤥ
᥋ϟ
于 ጢᠮ ऊᨃ ܦሕᎮ ቩ 细胞培养箱中培养 ࿗ऐ ၤᤥ 每孔加
԰
入 ϟԡ ဂᓂ 浓度为 ጢቝ੫ኼቝᓂ 的 ᥘఋఋ 溶液ᖔ放置在
᥋ϟ
培养箱中继续培养 ࿗ၤᤥ 弃掉上清液ᖔ每孔加入
᧕ᥘ୩ᨃ ϟᤃԡ ဂᓂᖔ震荡 ϟጢ ቝᔽႿ 使得甲臜紫色结晶完
全溶解ᤥ 将 ँᤃ 孔板按要求放置于酶标仪中ᖔ选择
的波长为 ࿗ँԡ Ⴟቝᖔ在此条件下测定吸光度 ᨃ᧕ 值ᤥ
根据测得的 ᨃ᧕ 值计算细胞抑制率ᤥ
抑制率ྉᠮɯᢉ Џ᧣ᦵ ͱ᧣ᦵ ૒ᣰ ᧣ᦵ ġϟԡԡᤥ
空白组 给药组 空白组
԰঎԰঎԰ ̀ᆍᔀዹၤ༁ᡷ 染色জ 收集对数生长期 ୩̀᥋୩ɟጢɟ 细
胞ܦ᣽ጢᤃ԰ 细胞ܦ̀ᔀ᤟ 细胞ᖔ重悬得到细胞悬液并进
行细胞计数ᖔ均匀铺于 ᤃ 孔板中ᖔ在 ጢᠮ ऊᨃ ܦሕᎮ ቩ
԰
条件下的细胞培养箱中培养待其贴壁ᖔ细胞密度
长至 Ꭾԡᠮ ጲ ऐԡᠮ时加入不同浓度的药物ྉ终浓度为
ϟԡܦ԰ԡܦጢԡ ဂቝᆍ᤟ኼᓂ ɯᖔ继续培养 ԰࿗ ၤᖔ弃去培养
᥋ϟ
液ᖔ先加入 ԡ঎ऐ ቝᓂ 细胞染色缓冲液ᖔ再加入 ጢဂᓂ
̀ᆍᔀዹၤ༁ᡷ 染色液ᖔ最后加入 ጢဂᓂ ۪᧧ 染色液ᖔ混匀ᖔ࿗
ቩ 孵育 ԰ጢ ቝᔽႿᖔ弃去染色液ᖔ用 ۪ା୩ 洗涤 ϟ 次ᖔ在
荧光显微镜下观察并拍照ᤥ 对 ᣽ጢᤃ԰ 细胞和 ̀ᔀ᤟
ጢ ᤃ
细胞每个样品收集 ϟ uϟԡ ጲϟ uϟԡ 个细胞于 ϟ঎ጢ ቝᓂ
离心管内ᖔ离心ᖔ弃去上清液ᤥ 细胞沉淀用 ԡ঎ऐ ቝᓂ
细胞染色液重悬ᖔ先加入 ጢ ဂᓂ ̀ᆍᔀዹၤ༁ᡷ 染色液ᖔ再
加入 ጢဂᓂ ۪᧧ 染色液ᖔ混匀ᖔ࿗ ቩ 孵育 ԰ጢ ቝᔽႿᖔ۪ା୩
洗涤 ϟ 次ᖔ流式细胞仪检测ᤥ
԰঎԰঎ሕ 统计学方法জ 所有数据均用 ୩۪୩୩ ϟᎮ঎ ԡ 软件
进行统计分析ᖔ用 ଝō໧ 表示ᖔ组间比较多用 Þ 检验ᤥ
ሕজ 化合物结构鉴定结果
化合物 ϓ জ 无色油状液体ᖔጶ୩᧧᥋ᥘ୩ ቂᣑ ऊ᧥࿗࿗Ꭾ
շ ϟ
Џᥘ շ શᑕ૒ ᖔ分子式 ऊ ̀ ᨃᤥ ̀᥋શᥘ኏ྉ ᤃԡԡ ᥘ̀झᖔ
ሕԡ
࿗ऐ
ऊ᧕ऊ᤟ ɯ Р᧥ጢ঎ϟጢ ᣰ ጢ঎԰ϟྉ ᡷᖔ ȣ ᢉ ሕ঎ᤃ ̀झᖔ ϟ̀ᖔ ̀᥋ϟ԰ɯᖔ
ሕ
ϟ঎ϟԡྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋԰ሕɯᖔ ϟ঎ԡᤃྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋԰࿗ɯᖔ ϟ঎ԡऐ ᣰ
ϟ঎ԡᎮྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋԰ጢɯᖔ ϟ঎ԡᤃ ᣰ ϟ঎ԡ԰ྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋԰ᤃɯᖔ
ϟ঎ԡऐ ᣰ ϟ঎ϟጢྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋԰Ꭾɯ ᖔ ԡ঎ऐϟ ᣰ ԡ঎ऐ࿗ྉ ༁ᖔ ሕ̀ᖔ ̀᥋