Page 85 - 《广西植物》2023年第11期

１１ 期 殷斯等: 西南地区六种魔芋属植物基于 ｃｐＤＮＡ 序列的遗传多样性研究 ２ ０ ４ ５

１.２ ＰＣＲ 扩增和测序 序列构建 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｎｅｔ 树ꎬ评估魔芋种间的网状进
利用已发表的引物对 ｔｒｎＫ￣ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ 和 ｔｒｎＬ 化关系(Ｈｕｓｏｎ ＆ Ｂｒｙａｎｔꎬ ２００６)ꎮ
３ 个 ｃｐＤＮＡ 片段进行 ＰＣＲ 扩增(表 ２)ꎮ ＰＣＲ 扩增

体系总体积为 ３０ μＬꎬ包含 ２０ ~ ５０ ｎｇ ＤＮＡ 模板ꎬ ２ 结果与分析
￣１
正、反 向 引 物 ( １０ μｍｏｌ Ｌ )ꎬ ２ × ＰＣＲ ＳｔａｒＭｉｘ
(ＧｅｎＳｔａｒ)和 ｄｄＨ Ｏ 等ꎮ 反应程序:预变性ꎬ９５ ℃ ꎬ ２.１ ｃｐＤＮＡ 序列扩增
２
５ ｍｉｎꎻ３５ 个扩增循环ꎬ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５６ ℃ 退火 对来源于 ２８ 个野生群体的 １７０ 个样本分别
３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ６０ ｓꎻ终延伸ꎬ７２ ℃ ꎬ７ ｍｉｎꎮ 扩增 进行 ｃｐＤＮＡ 序列扩 增ꎬ３ 个 ｃｐＤＮＡ 片 段 的 电 泳
产物经 １.５％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ合格产物送生 检测结果表明ꎬＰＣＲ 目的产物条带清晰ꎬ符合测

工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序ꎮ 序要求( 图 １) ꎮ
２.２ 基于 ｃｐＤＮＡ 的物种遗传变异与遗传多样性
表 ２ ｃｐＤＮＡ 片段扩增所用引物序列
经样本间的序列拼接和比对ꎬ得到的 ３ 个叶绿
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
体片段 ｔｒｎＫ￣ｍａｔＫ、ｒｂｃＬ 和 ｔｒｎＬ 的序列长度分别为
ｏｆ ｃｐＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
７１９、１ ３１２、３１５ ｂｐꎮ 将同一个体的 ３ 条序列串联进
ｃｐＤＮＡ
标记 引物序列 参考文献 行整体分析ꎬ序列总长度为 ２ ３４６ ｂｐꎮ 在所有样本
ｃｐＤＮＡ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ 序列中检测到 １２８ 个多态性位点ꎬ其中插入/ 缺失突
ｍａｒｋｅｒ
变位点 ７８ 个ꎬ共得到 ５７ 个单倍型ꎮ 遗传多样性分
ｔｒｎＫ￣ｍａｔＫ Ｆ: ５′￣ＣＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＣＡ￣３′ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆
Ｒ: ５′￣ＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＣ￣３′ Ｓｏｌｔｉｓꎬ 析表明ꎬ群体遗传多样性较低ꎬ核苷酸多样性(用 π
１９９４
表示)在 ０~０.００９ ３１ 之间ꎮ 在部分群体只有一个单
ｒｂｃＬ Ｆ: ５′￣ＡＴＧＴＣＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣ￣３′ Ｏｌｍｓｔｅａｄ
Ｒ: ５′￣ＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＴＧＧＧＣＣＧＡＧ￣３′ ｅｔ ａｌ.ꎬ 倍型(２６ 个群体中的 １２ 个)ꎬ群体 ＤＷ(疣柄魔芋)
１９９２
和 ＮＪＺ(疣柄魔芋) 具有最高的群体单倍型多样性
ｔｒｎＬ Ｆ: ５′￣ＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧ￣３′ Ｔａｂｅｒｌｅｔ (Ｈ ＝ １.０)ꎮ 在物种水平ꎬ每个物种的单倍型数量从
Ｒ: ５′￣ＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣ￣３′ ｅｔ ａｌ.ꎬ ｄ
４ 到 １４ 不等ꎬ其中疣柄魔芋和东京魔芋的遗传多样
１９９１
性较高(表 ３)ꎮ 在花魔芋、东京魔芋、西盟魔芋和滇
１.３ 数据分析 魔芋的种内群体间发现了共享单倍型ꎬ但 ６ 个物种
采用 Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ 软 件 的 Ｓｅｑｍａｎ 工 具 对 ３ 个 之间没有共有单倍型存在ꎮ 物种间的两两遗传分
ｃｐＤＮＡ 片 段 进 行 拼 接 ( ＤＮＡＳｔａｒ Ｉｎｃ.ꎬ Ｍａｄｉｓｏｎꎬ 化表明ꎬ花魔芋和滇魔芋两个物种间的遗传分化系
ＷＩꎬ ＵＳＡ)ꎻ使用 ＭＥＧＡ ｖ７.０ 的 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 算法对所 数最高(Ｆ ＝ ０.９４２)ꎬ而花魔芋和西盟魔芋的遗传
ＳＴ
有样本的 ＤＮＡ 序列进行比对ꎬ将同一个体的 ３ 个 分化系数最低ꎬＦ 为 ０.４８１(表 ４)ꎮ
ＳＴ
ｃｐＤＮＡ 片 段 序 列 串 联 作 为 一 个 整 体 进 行 分 析 ２.３ 魔芋属系统发育关系
(Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 在遗传多样性评估时ꎬ将 为评估魔芋属各物种的系统发育关系ꎬ结合
连续多 碱 基 的 插 入 / 缺 失 突 变 视 为 单 突 变 事 件 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库下载的 ２１ 个魔芋物种的 ｃｐＤＮＡ
(Ｓｉｍｍｏｎｓ ＆ Ｏｃｈｏｔｅｒｅｎａꎬ ２０００)ꎮ 为减少误差ꎬ样 序列进行系统发生分析(表 ５)ꎬ根据 ＢＩＣ( Ｂａｙｅｓｉａｎ
本量少于 ３ 个的群体(ＫＺＳＭＹ、ＧＸＫＫ)不用于群体 ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ)评分ꎬＨＫＹ＋Ｆ＋Ｒ２ 模型被检测
遗传多样性分析ꎮ 采用 Ａｒｌｅｑｕｉｎ 软件评估 ６ 个物 为最优核酸替换模型ꎮ 最大似然树表明ꎬ２７ 个魔
种间的遗传分化系数( Ｆ )ꎬ并用 １ ０００ 次模拟运 芋物种聚成 ３ 个主要分支ꎬ即非洲分支、东南亚分
ＳＴ
算评估显著性(Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ ＆ Ｌｉｓｃｈｅｒꎬ ２０１０)ꎮ 支和东亚大陆分支ꎮ 本研究关注的 ６ 个物种则以
为评估魔芋 ６ 个物种之间的亲缘关系及系统 较高的支持率分别被划分在东亚大陆分支和东南

进化地位ꎬ本研究使用 ＩＱ￣ＴＲＥＥ １.６.１２ 对 ｃｐＤＮＡ 亚分支ꎬ疣柄魔芋列入东南亚分支ꎮ 东亚大陆分
单倍型序列进行核酸替代模型检测ꎬ构建最大似 支又进一步分化为两支( 分支 Ａ 和分支 Ｂ)ꎬ分支
然法( ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬＭＬ) 系统进化树ꎬ运行 Ａ 包含花魔芋和西盟魔芋ꎬ分支 Ｂ 由东亚魔芋、滇
１ ０００ 次 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 检 测 显 著 性 ( Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ 魔芋和东京魔芋构成 ( 图 ２)ꎮ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｎｅｔ 网状
２０１４)ꎮ 此外ꎬ采用 ＳｐｌｉｔｓＴｒｅｅ ４.１４.６ 对所有单倍型 进化分析的结果与 ＭＬ 树基本一致ꎬ 支持东亚魔