Page 17 - 《广西植物》2024年第10期

１０ 期 邓晓娟等: 六盘山区幼龄蒙古栎根系共生真菌的分离和鉴定 １ ８ １ ９

度 ６９％ꎬ属暖温带半湿润区的大陆性季风气候(王 １.４ 根系共生真菌分子鉴定
香亭ꎬ １９８８)ꎮ 六盘山区蒙古栎主要分布于海拔 １.４.１ 真菌 ＤＮＡ 提取 待纯化的菌丝长满固体平板
１ １００~１ ６５０ ｍ 之间的缓坡和阴坡、半阴坡、半阳向 后ꎬ在无菌环境中ꎬ使用铁丝制作成的三角形刮板

沟坡地ꎮ 刮取表面菌丝进行收集ꎬ称取菌丝体约 ０.５ ｇꎬ按照
１.２ 样品采集 上海生工 ＵＮＩＱ￣１０ 柱式真菌基因组试剂盒的说明
２０２２ 年 ７—９ 月ꎬ在六盘山国家级自然保护区 书进行 ＤＮＡ 抽提ꎮ
秋千架景区ꎬ选取 ３ 个 ５０ ｍ × ５０ ｍ 的蒙古栎纯林 １.４.２ 真菌 ｒＤＮＡ ＩＴＳ 序列 ＰＣＲ 扩增 采用真菌通
作为试验样地ꎮ 根据张婕等(２０１４) 蒙古栎种群径 用引 物 ＩＴＳ１Ｆ ( ５′￣ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ￣
级结构的划分标准ꎬ结合六盘山蒙古栎种群的实际 ３′)和 ＩＴＳ４(５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′)进行
生长情况ꎬ以 ４ 个不同树龄(１ 年生、２ 年生、３ 年生 菌落的 ＰＣＲ 扩增ꎮ 反应体系以 ５０ μＬ 为例:２×Ｈｉｅｆ

和 ４~５ 年生) 的幼龄蒙古栎作为研究对象ꎬ依据 ５ ＰＣＲ Ｍａｓｔｒ Ｍｉｘ ２５ μＬꎬＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ １０ μｍｏｌＬ ￣１
点采样法原则ꎬ分别采集不同树龄蒙古栎植株的整 ２. ５ μＬꎬ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ １０ μｍｏｌ Ｌ ￣１ ２. ５ μＬꎬ
个根系各 ５ 份ꎬ共 ６０ 份样品ꎮ 采样时ꎬ用铁锹除去 Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ２ μＬꎬｄｄＨ Ｏ 补足 ５０ μＬꎮ 反应条件
２
植株基部周围的地表覆盖物ꎬ将整个植株完整挖出 如表 １ 所示ꎬ对检测合格的样品送至生工生物工程
并剪下所有根系放入自封袋中ꎬ根系周围保留少量 (上海)股份有限公司测序ꎮ
土壤用于保鲜ꎬ采集的根样于冰箱 ４ ℃ 冷藏ꎬ３ ｄ 内
带回实验室进行后续处理ꎮ 表 １ ｒＤＮＡ ＩＴＳ 序列的 ＰＣＲ 扩增程序
１.３ 根系共生真菌的分离 Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
在实验室将根样置于培养皿内ꎬ加入清水浸 温度 时间 循环数
循环步骤
泡ꎬ待根样表面土壤松软后ꎬ用细小毛刷小心地移 Ｃｙｃｌｉｃ ｓｔｅｐ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｔｉｍｅ Ｃｙｃｌｅ
(℃ ) (ｍｉｎ) ｎｕｍｂｅｒ
除根表面的土壤并剔除杂草等其他植物根系ꎬ蒸馏
预变性 Ｐｒｅｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ９５ ５ １
水冲洗根系 ３ ~ ５ 次ꎮ 采用根段直接培养法进行根
变性 Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９４ １ —
系共生真菌分离ꎬ分离和纯化采用马铃薯葡萄糖琼
退火 Ａｎｎｅａｌ ５２ １ ３０
脂培养基(马铃薯 ２００ ｇＬ 、葡萄糖 ２０ ｇＬ 、琼
￣１
￣１
延伸 Ｅｘｔｅｎｄ ７２ １ —
￣１
脂粉 １６ ｇＬ )ꎬ待培养基常温冷却至 ４５ ℃ 左右ꎬ
终延伸 Ｆｉｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ７２ １０ １
￣１
加入终浓度 ５０ ｍｇＬ 氨苄青霉素抑制细菌生长ꎮ
每份样品挑取 ３０ 个末端 ２ ｃｍ 的根系ꎬ依据不同树
龄ꎬ采取不同的消毒方法ꎮ １ 年生、２ 年生的根系ꎬ采 １.４.３ ＩＴＳ 序列分析 对真菌测序结果的分析参照
取 ２ 步消毒法ꎬ即先将准备好的根系于 ７０％的酒精 李敏奇等( ２０２３) 的方法进行分析并构建系统发
中浸泡 ２ ｍｉｎꎬ再于 ０.１％氯化汞中浸泡 ４０ ｓꎬ每次浸 育树ꎮ
泡后用无菌水漂洗 ３ 次ꎬ最后一次漂洗之后用无菌 １.５ 根系共生真菌数量统计分析
滤纸吸干水分ꎮ ３ 年生、４~５ 年生的根段ꎬ在 ２ 步消 幼龄蒙古栎根系不同共生真菌的分离数量采

毒的基础上ꎬ再将根系置于 ７０％ 的酒精中浸泡 １ 用分离频率分析ꎮ 分离频率(％) ＝ ( 分离的某种
ｍｉｎꎬ无菌水漂洗 ３ 次后吸干水分ꎮ 将消毒后的根系 共生真菌的菌株数 / 分离的总菌株数) ×１００ꎮ
切成 ０.２~０.３ ｃｍ 的根段ꎬ 每个 ＰＤＡ 平板放置 ４ 个
根段ꎬ每份样品接根段 １００ 个ꎬ生化培养箱 ２５ ℃ 黑 ２ 结果与分析
暗 培 养ꎮ 菌 落 纯 化 参 照 肉 斯 塔 木 艾 买 提 等
(２０２２)的方法ꎬ菌落形态特征描述依据 ＭｃＬｅａｎ 等 ２.１ 根系共生真菌菌落特征观察
(１９９９)和 Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ(２００１)的方法ꎬ详细记录菌落颜 从幼龄蒙古栎根系中共分离纯化得到 ２４９ 株
色、质地、外形、是否有分泌物、边缘颜色及形状、直 真菌ꎬ依据菌落形态特征分为 １８ 个类型( 图 １ꎬ表
径ꎮ 分离纯化后的所有菌株保藏于北方民族大学 ２)ꎮ 菌落多为圆形ꎬ少数是椭圆形ꎬ颜色有白色、
宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室 黄白色、灰色、灰黑色、棕黄色、黑色等ꎬ大部分菌
的微生物菌种保藏中心ꎮ 落不产色素ꎬ不同菌落类型生长速度差异较大ꎬ 多