Page 64 - 《广西植物》2025年第1期
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6 0                                    广  西  植  物                                         45 卷
            在叶绿体发育中起着关键的作用ꎮ 在受到逆境                              lymma aurantiacum、Neojobertia candolleana、白花母
            胁迫ꎬ如在高温和干旱( Bi et al.ꎬ 2016) 及盐胁迫                  兰 ( Pleonotoma albiflora )、 硬 骨 凌 霄 ( Tecoma
            下( Sehar et al.ꎬ 2021) 植物叶片中基因 psbB 的表             capensis)的叶绿体基因组序列ꎮ 提取 11 种植物叶

            达显著升高ꎬ在重金属胁迫下受到抑制( Li et al.ꎬ                      绿体基因组 45 个共有 CDS 核苷酸序列ꎬ用 MAFFT
            2020) ꎬ但在冷胁迫下该基因的表现如何鲜见报                           (v. 7)(Katoh & Standleyꎬ 2013) 软件进行序列比
            道ꎮ 因此ꎬ本研究组装、注释获得了海滨猫尾木                             对ꎬ分析结果用 MEGA 11(Koichiro et al.ꎬ 2021)软
            完整叶绿体基因组并进行了特征分析ꎮ 对海滨                              件构建最大似然(maximum likelihoodꎬML)树ꎮ
            猫尾木幼苗进行冷胁迫处理ꎬ分析生理指标和叶                              1.2.4 冷胁迫实验及生理指标的测定  待 1.2.1 培
            绿体编码 基 因 psbB 的 表 达 特 征ꎬ拟 探 讨 以 下 问                育的幼苗长到 8 ~ 10 片叶时ꎬ进行不同温度胁迫处

            题:(1) 海滨猫尾木叶绿体基因组的 结 构 特 征ꎻ                        理ꎬ每个处理时长 48 hꎬ温度梯度为 28 ℃ / 25 ℃
            (2) 海 滨 猫 尾 木 幼 苗 在 冷 胁 迫 下 的 生 理 响 应ꎻ             (CK)、15 ℃ / 12 ℃ ( T1)、10 ℃ / 5 ℃ ( T2) 和恢复
            (3) 冷胁迫下叶绿体编码基因 psbB 的表达特征ꎮ                        15 ℃ / 12 ℃ ( T3ꎬ其中温度模式为光照 / 黑暗)ꎬ每
            以期为 揭 示 该 植 物 冷 胁 迫 分 子 响 应 机 制 补 充                个处理 5 株植物ꎮ 采集幼苗倒数 2 ~ 3 对叶测量生
            内容ꎮ                                                理指标ꎬ总叶绿素由上海科艾博生物植物总叶绿
                                                               素 ELISA 检测试剂盒测定ꎬ丙二醛、脯氨酸、总酚
            1  材料与方法                                           和可溶性糖由北京索莱宝科技有限公司相应微量
                                                               法试剂盒提取ꎬ可溶性蛋白用北京索莱宝科技有
            1.1 实验材料                                           限公司植物蛋白试剂盒提取ꎬ再用考马斯亮蓝法
                 海滨猫尾木种子采自中国海南岛的三亚铁炉                           测定蛋白含量ꎮ
            港(109°32′50″ E、18°14′26″ N) 且健康、无虫害植               1.2.5 基因 psbB 在冷胁迫植株中的表达  使用诺
            株ꎬ同时 在 海 南 师 范 大 学 标 本 室 保 存 相 应 标 本               维赞公司试剂盒(FastPure plant Total RNA Isolation
            (DC ̄001)ꎮ                                          Kit) 提 取 海 滨 猫 尾 木 叶 片 总 RNAꎮ cDNA 由
            1.2 实验方法                                           Takara 公司( PrimeScript TM FAST RT) 试剂盒合
            1.2.1 基因组 DNA 提取与测序  先将种子在清水                       成ꎮ 根据 psbB 基因序列使用 Primer 6.0 软件设计
            中浸泡 24 hꎬ再植入含 60% 沙+40% 土壤培养基                      引 物 如 下: 上 游 引 物               psbB ̄F  为   5′ ̄
            的塑料箱(20 cm × 30 cm) 中ꎬ最后移入苗木培育                     AGAGATAAAGAAGGGCGTGAGC ̄3′ꎬ 下 游 引 物
            室( 光照 14 hꎬ黑暗 10 hꎬ湿度 60% ~ 80%ꎬ温度                 psbB ̄R 为 5′ ̄CCATTGAGTTCGCCGCCAT ̄3′ꎻ 内 参
            25 ~ 28 ℃ ) 进行培育ꎮ 待 4 ~ 6 片叶时ꎬ采集幼嫩                 基 因 为 拟 南 芥 U6 基 因ꎬ 上 游 引 物 U6 ̄F 为 5′ ̄
            叶片ꎬDNA 提取试剂盒(TransGenꎬ中国) 提取基因                     ACATCCGATAAAATTGGAACGA ̄3′ꎬ下游引物 U6 ̄
            组 DNAꎮ 并在 Illumina HiSeq 平台(杭州惠通生物                 R:5′ ̄TTTTTTTGGACCATTTCTCGAT ̄3′ꎮ 根据北京
            技术有限公司)进行末端 150 bp 读数测序ꎮ                           全式金 Perfectstart Green qPCR 试剂盒说明书三步
            1.2.2 叶绿体全基因组序列组装、注释及图谱绘制                          法进行荧光定量 PCR 验证实验ꎬ方法如下:94 ℃
              通过 Fastqc 软件评估原始测序数据质量ꎮ 利用                       30 sꎬ1 个循环ꎻ94 ℃ 5 sꎬ60 ℃ 15 sꎬ72 ℃ 10 sꎬ40
            在线注释工具 DOGMA( Wyman et al.ꎬ 2004) 对叶               个循环ꎻ反应体系 20 μLꎮ
            绿体基因组进行注释ꎮ 通过 ORF 预测以及 NR 数
            据库比对ꎬ确定注释结果( 尚明越等ꎬ2023)ꎮ 用                         2  结果与分析

            OGDRAW 软件绘图(Greiner et al.ꎬ 2019)ꎮ
            1. 2. 3 系 统 发 育 分 析      以 拟 南 芥 ( Arabidopsis     2.1 叶绿体基因组结构特征
            thaliana)和狭叶恋岩花( Echinacanthus attenuatus)             如图 1 所示的海滨猫尾木叶绿体基因组四分
            作为外类群ꎬ从 GenBank 数据库下载 8 种紫葳科                       体结构ꎬ全长 159 139 bpꎬGC 含量 37.9%ꎬAT 含量
            植物楔叶杯领藤( Amphilophium cuneifolium)、黄葳              62.1%ꎬ具有明显的 AT 偏向性ꎮ 2 个大小相同、方
            (Anemopaegma chamberlaynii)、鹰爪滕( Dolichandra       向相反的反向重复区( inverse repeatsꎬIRs) 分隔出
            cynanchoides)、 Tanaecium tetragonolobum、 Adenoca ̄  大单拷贝区(large single copyꎬLSC) 和小单拷贝区
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