Page 64 - 《广西植物》2025年第1期
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６ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
在叶绿体发育中起着关键的作用ꎮ 在受到逆境 ｌｙｍｍａ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ、Ｎｅｏｊｏｂｅｒｔｉａ ｃａｎｄｏｌｌｅａｎａ、白花母
胁迫ꎬ如在高温和干旱( Ｂｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６) 及盐胁迫 兰 ( Ｐｌｅｏｎｏｔｏｍａ ａｌｂｉｆｌｏｒａ )、 硬 骨 凌 霄 ( Ｔｅｃｏｍａ
下( Ｓｅｈａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１) 植物叶片中基因 ｐｓｂＢ 的表 ｃａｐｅｎｓｉｓ)的叶绿体基因组序列ꎮ 提取 １１ 种植物叶
达显著升高ꎬ在重金属胁迫下受到抑制( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ 绿体基因组 ４５ 个共有 ＣＤＳ 核苷酸序列ꎬ用 ＭＡＦＦＴ
２０２０) ꎬ但在冷胁迫下该基因的表现如何鲜见报 (ｖ. ７)(Ｋａｔｏｈ ＆ Ｓｔａｎｄｌｅｙꎬ ２０１３) 软件进行序列比
道ꎮ 因此ꎬ本研究组装、注释获得了海滨猫尾木 对ꎬ分析结果用 ＭＥＧＡ １１(Ｋｏｉｃｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)软
完整叶绿体基因组并进行了特征分析ꎮ 对海滨 件构建最大似然(ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬＭＬ)树ꎮ
猫尾木幼苗进行冷胁迫处理ꎬ分析生理指标和叶 １.２.４ 冷胁迫实验及生理指标的测定 待 １.２.１ 培
绿体编码 基 因 ｐｓｂＢ 的 表 达 特 征ꎬ拟 探 讨 以 下 问 育的幼苗长到 ８ ~ １０ 片叶时ꎬ进行不同温度胁迫处
题:(１) 海滨猫尾木叶绿体基因组的 结 构 特 征ꎻ 理ꎬ每个处理时长 ４８ ｈꎬ温度梯度为 ２８ ℃ / ２５ ℃
(２) 海 滨 猫 尾 木 幼 苗 在 冷 胁 迫 下 的 生 理 响 应ꎻ (ＣＫ)、１５ ℃ / １２ ℃ ( Ｔ１)、１０ ℃ / ５ ℃ ( Ｔ２) 和恢复
(３) 冷胁迫下叶绿体编码基因 ｐｓｂＢ 的表达特征ꎮ １５ ℃ / １２ ℃ ( Ｔ３ꎬ其中温度模式为光照 / 黑暗)ꎬ每
以期为 揭 示 该 植 物 冷 胁 迫 分 子 响 应 机 制 补 充 个处理 ５ 株植物ꎮ 采集幼苗倒数 ２ ~ ３ 对叶测量生
内容ꎮ 理指标ꎬ总叶绿素由上海科艾博生物植物总叶绿
素 ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒测定ꎬ丙二醛、脯氨酸、总酚
１ 材料与方法 和可溶性糖由北京索莱宝科技有限公司相应微量
法试剂盒提取ꎬ可溶性蛋白用北京索莱宝科技有
１.１ 实验材料 限公司植物蛋白试剂盒提取ꎬ再用考马斯亮蓝法
海滨猫尾木种子采自中国海南岛的三亚铁炉 测定蛋白含量ꎮ
港(１０９°３２′５０″ Ｅ、１８°１４′２６″ Ｎ) 且健康、无虫害植 １.２.５ 基因 ｐｓｂＢ 在冷胁迫植株中的表达 使用诺
株ꎬ同时 在 海 南 师 范 大 学 标 本 室 保 存 相 应 标 本 维赞公司试剂盒(ＦａｓｔＰｕｒｅ ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
(ＤＣ￣００１)ꎮ Ｋｉｔ) 提 取 海 滨 猫 尾 木 叶 片 总 ＲＮＡꎮ ｃＤＮＡ 由
１.２ 实验方法 Ｔａｋａｒａ 公司( ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＦＡＳＴ ＲＴ) 试剂盒合
１.２.１ 基因组 ＤＮＡ 提取与测序 先将种子在清水 成ꎮ 根据 ｐｓｂＢ 基因序列使用 Ｐｒｉｍｅｒ ６.０ 软件设计
中浸泡 ２４ ｈꎬ再植入含 ６０％ 沙＋４０％ 土壤培养基 引 物 如 下: 上 游 引 物 ｐｓｂＢ￣Ｆ 为 ５′￣
的塑料箱(２０ ｃｍ × ３０ ｃｍ) 中ꎬ最后移入苗木培育 ＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣ￣３′ꎬ 下 游 引 物
室( 光照 １４ ｈꎬ黑暗 １０ ｈꎬ湿度 ６０％ ~ ８０％ꎬ温度 ｐｓｂＢ￣Ｒ 为 ５′￣ＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴ￣３′ꎻ 内 参
２５ ~ ２８ ℃ ) 进行培育ꎮ 待 ４ ~ ６ 片叶时ꎬ采集幼嫩 基 因 为 拟 南 芥 Ｕ６ 基 因ꎬ 上 游 引 物 Ｕ６￣Ｆ 为 ５′￣
叶片ꎬＤＮＡ 提取试剂盒(ＴｒａｎｓＧｅｎꎬ中国) 提取基因 ＡＣＡＴＣＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡ￣３′ꎬ下游引物 Ｕ６￣
组 ＤＮＡꎮ 并在 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ 平台(杭州惠通生物 Ｒ:５′￣ＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＴ￣３′ꎮ 根据北京
技术有限公司)进行末端 １５０ ｂｐ 读数测序ꎮ 全式金 Ｐｅｒｆｅｃｔｓｔａｒｔ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ 试剂盒说明书三步
１.２.２ 叶绿体全基因组序列组装、注释及图谱绘制 法进行荧光定量 ＰＣＲ 验证实验ꎬ方法如下:９４ ℃
通过 Ｆａｓｔｑｃ 软件评估原始测序数据质量ꎮ 利用 ３０ ｓꎬ１ 个循环ꎻ９４ ℃ ５ ｓꎬ６０ ℃ １５ ｓꎬ７２ ℃ １０ ｓꎬ４０
在线注释工具 ＤＯＧＭＡ( Ｗｙｍａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４) 对叶 个循环ꎻ反应体系 ２０ μＬꎮ
绿体基因组进行注释ꎮ 通过 ＯＲＦ 预测以及 ＮＲ 数
据库比对ꎬ确定注释结果( 尚明越等ꎬ２０２３)ꎮ 用 ２ 结果与分析
ＯＧＤＲＡＷ 软件绘图(Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ
１. ２. ３ 系 统 发 育 分 析 以 拟 南 芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ２.１ 叶绿体基因组结构特征
ｔｈａｌｉａｎａ)和狭叶恋岩花( Ｅｃｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ ａｔｔｅｎｕａｔｕｓ) 如图 １ 所示的海滨猫尾木叶绿体基因组四分
作为外类群ꎬ从 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库下载 ８ 种紫葳科 体结构ꎬ全长 １５９ １３９ ｂｐꎬＧＣ 含量 ３７.９％ꎬＡＴ 含量
植物楔叶杯领藤( Ａｍｐｈｉｌｏｐｈｉｕｍ ｃｕｎｅｉｆｏｌｉｕｍ)、黄葳 ６２.１％ꎬ具有明显的 ＡＴ 偏向性ꎮ ２ 个大小相同、方
(Ａｎｅｍｏｐａｅｇｍａ ｃｈａｍｂｅｒｌａｙｎｉｉ)、鹰爪滕( Ｄｏｌｉｃｈａｎｄｒａ 向相反的反向重复区( ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅａｔｓꎬＩＲｓ) 分隔出
ｃｙｎａｎｃｈｏｉｄｅｓ)、 Ｔａｎａｅｃｉｕｍ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｍ、 Ａｄｅｎｏｃａ￣ 大单拷贝区(ｌａｒｇｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙꎬＬＳＣ) 和小单拷贝区
