Page 20 - 《广西植物》2025年第12期

２ １ ６ ２ 广 西 植 物 ４５ 卷
示ꎬ梅衣科、蜈蚣衣科( Ｐｈｙｓｃｉａｃｅａｅ Ｚａｈｌｂｒ.)、石蕊 心机( Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｄｆｕｇｅ ５４１７Ｒ) 以 １４ ０００ ｒ
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科( Ｃｌａｄｏｎｉａｃｅａｅ Ｚｅｎｋｅｒ) 和 茶 渍 科 ( Ｌｅｃａｎｏｒａｃｅａｅ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ上清液即为样品的基因组 ＤＮＡꎬ
Ｋöｒｂ.)为该区域的优势科ꎮ 然而ꎬ目前尚无学者对 将 ＤＮＡ 转移至收集管后稀释 １０ 倍ꎮ ＰＣＲ 扩增以
上述地衣类群开展分类研究ꎬ本底数据缺乏ꎮ 本 ＩＴＳ１ｆ( Ｇａｒｄｅｓ ＆ Ｂｒｕｎｓꎬ １９９３) 和 ＩＴＳ４ａ ( Ｌａｒｅｎａ ｅｔ
研究针对该区域属种多样性最高、生物量最大且 ａｌ.ꎬ１９９９) 为引物ꎬ扩增体系总体积为 ２５ μＬ( ２ ×
具有多领域开发潜力的梅衣科地衣开展分类研 Ｔｒｉｏ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ９.５ μＬꎬ引物各
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究ꎬ澄清该科的物种组成和资源分布ꎬ明确物种鉴 １ μＬꎬ模板 ＤＮＡ １ μＬ)ꎮ 扩增程序:９４ ℃ 预变性 ５
定特征ꎬ对长江三角洲及邻近区域梅衣科地衣的 ｍｉｎꎬ３５ 次循环(９４ ℃ 变性 １５ ｓꎬ５３ ℃ 退火 １５ ｓꎬ７２
药用、生态及经济价值评估和可持续利用具有重 ℃ 延伸 １ ｍｉｎ)ꎬ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存( 何宣

要意义ꎮ 宣和贾泽峰ꎬ２０２３)ꎮ 扩增产物送至通用生物( 安
徽)股份有限公司进行纯化和双向测序ꎮ
１ 材料与方法 １.５ 序列比对和系统发育分析
公司返回序列在 ＮＣＢＩ 上使用 ＢＬＡＳＴ 工具进
１.１ 研究材料 行 比 较 分 析 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
研究标本于 ２０２１—２０２４ 年间采自安徽省大别 Ｂｌａｓｔ. ｃｇｉ)ꎬ 确 定 为 地 衣 型 真 菌 序 列 后ꎬ 采 用
山区各市县ꎬ现存放于安徽师范大学生命科学学 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ 软件对双向序列进行拼接并去除
院植物标本馆( ＡＨＵＢ) 和中国科学院昆明植物研 两侧模糊碱基ꎮ 在 ＧｅｎＢａｎｋ 中下载了 ４１ 条同科
究所地衣标本馆(ＫＵＮ￣Ｌ)ꎮ ＩＴＳ 参 考 序 列 和 ２ 条 外 类 群 大 叶 鳞 型 衣
１.２ 形态特征观察 [ Ｇｙｐｓｏｐｌａｃａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ( Ｚａｈｌｂｒ.) Ｔｉｍｄａｌ] 序 列
地衣体形态特征观察和 拍 照 在 体 式 显 微 镜 (Ａｒｕｐ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００７)ꎬ与本研究获得的 ４５ 条梅衣科
ＯＬＹＭＰＵＳ ＳＺ６１ＴＲ 和相机 ＭＳ６０￣２ 下完成ꎬ显微特 序列 共 同 组 成 矩 阵 ( 表 １ )ꎮ 使 用 ＭＡＦＦＴ ｖ. ７
征观 察 在 正 置 偏 光 显 微 镜 ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ４３ 下 (Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１９)的 Ｅ￣ＩＮＳ￣ｉ 策略进行序列比对ꎬ
完成ꎮ 最终用于建树的矩阵有 ５４４ 个碱基位点ꎮ 本研究
１.３ 化学方法 采用最大似然法( ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬＭＬ)ꎬ使用
本研究采用显色反应和薄层层析( ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ＩＱ￣ＴＲＥＥ 的 在 线 版 本 ( ｈｔｔｐ: / / ｉｑｔｒｅｅ. ｃｉｂｉｖ. ｕｎｉｖｉｅ.
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＴＬＣ)方法检测地衣化学物质ꎮ 显 ａｃ.ａｔ/ ꎻＴｒｉｆｉｎｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１６) 构建系统发育树ꎬ
色反应试剂为 Ｋ(１０％ＫＯＨ 溶液) 和 Ｃ [ Ｃａ( ＣｌＯ) 将 ＩＴＳ 划 分 为 ＩＴＳ１、 ５. ８Ｓ 和 ＩＴＳ２ ３ 个 分 区ꎬ ＩＱ￣
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溶液]ꎬ使用 ０.１ ｍｍ 毛细管点于地衣体表面及髓 ＴＲＥＥ 推测的各分区最适模型为 ＩＴＳ１( ＳＹＭ＋Ｇ４)、
层ꎬ观察颜色变化ꎮ 薄层层析根据文献资料中梅 ５.８Ｓ(Ｋ２Ｐ＋Ｉ)、ＩＴＳ２( ＴＩＭ３ｅ＋Ｇ４)ꎬ设置 １ ０００ 次重
衣科地衣化学物质的特性( Ｊａｙａｌａｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２ꎻ陈 复 计 算ꎮ 采 用 ＳＨ￣ａＬＲＴ ( ＳＨ￣ａＬＲＴ ｓｕｐｐｏｒｔ )
健斌ꎬ２０１５)ꎬ采用 Ａ 溶剂系统(甲苯 ∶ 二氧杂环己 ( Ｇｕｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０ )、 ａＢａｙｅｓ ( ａＢａｙｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔ)

烷 ∶ 乙 酸 ＝ １８０ ∶ ４５ ∶ ５ꎬ 体 积 比) ( Ｃｕｌｂｅｒｓｏｎ ＆ ( Ａｎｉｓｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ ) 和 ＵＦＢｏｏｔ ( Ｕｌｔｒａｆａｓｔ
Ｋｒｉｓｔｉｎｓｓｏｎꎬ１９７０) 和 Ｃ 溶 剂 系 统 ( 甲 苯 ∶ 乙 酸 ＝ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ) ( Ｍｉｎｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１３) ３ 种方
１００ ∶ １５ꎬ体积比)(Ｏｒａｎｇｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００１)ꎮ 法评 估 各 分 支 节 点 支 持 率ꎬ ＳＨ￣ａＬＲＴ (％) ≥ ８０、
１.４ ＤＮＡ 提取、ＰＣＲ 扩增和测序 ａＢａｙｅｓ≥０.９５ 或 ＵＦＢｏｏｔ(％)≥９５ 的分支被认为得
采用 Ｃｈｅｌｅｘ(弱阳离子螯合树脂) 法提取地衣 到良好支持ꎬ并以该次序呈现在系统发育树上( 图
体的基因组 ＤＮＡꎮ 分取 １ ｍｍ 大小的新鲜标本地 １)ꎮ 使用 ＭＥＧＡ ７ 将 系 统 发 育 树 可 视 化ꎬ 并 在
２
衣体尖端装入 ２ ｍＬ ＥＰ 管ꎬ使用植物组织研磨仪 ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔ ２０２１ 中进行美化编辑ꎮ
®
(ＭＰ ＦａｓｔＰｒｅｐ ￣２４) 将样品研磨成粉后ꎬ加入 １００
μＬ １０％Ｃｈｅｌｅｘ 溶液(５ ｇ Ｃｈｅｌｅｘ １００ Ｒｅｓｉｎ 粉末溶 ２ 结果与分析
®
于 ５０ ｍＬ ｄｄＨ Ｏ)ꎬ涡旋振荡 １０ ~ ３０ ｓꎮ 其后ꎬ在 ９５
２
℃ 下 的 金 属 浴 锅 ( ＪＯＡＮＬＡＢ ＤＢ１００) 中 放 置 ２０ ２.１ 系统发育学分析结果
ｍｉｎꎬ每 ５ ｍｉｎ 涡旋振荡一次ꎬ随后采用高速冷冻离 本研究新产生梅衣科 ４ 属 １５ 种的 ＩＴＳ 序列 ４５