Page 139 - 《广西植物》2025年第3期
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３ 期 李连春等: 地枫皮入血成分抗类风湿性关节炎作用研究 ５ １ ９
为地枫皮的干燥树皮ꎮ 将 １５ ｋｇ 地枫皮药材粗粉ꎬ １.２.５ 胶原诱导关节炎( ｃｏｌｌａｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓꎬ
用 ２０ Ｌ 的 ９５％乙醇于室温中浸泡 ２４ ｈꎮ 过滤ꎬ收 ＣＩＡ) 小鼠模型建立及给药 雄性 ＤＢＡ / １ 小鼠适
集滤液ꎬ药材重复浸提 ３ 次ꎮ 滤液于 ５０ ℃ 减压浓 应性饲养 １ 周后ꎬ随机分为空白对照组、ＣＩＡ 模型
缩成浸膏ꎬ浸膏用蒸馏水超声分散后ꎬ依次用石油 组、异红花八角醇低剂量组(４０ ｍｇｋｇ ｄ )、异
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醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取ꎬ减压去除溶 红花八角醇高剂量组(８０ ｍｇｋｇ ｄ ) 和甲氨蝶
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剂后得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙 呤组(１ ｍｇｋｇ ｄ ꎬ作为阳性对照)ꎬ每组 ６ 只ꎮ
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酯提取物和正丁醇提取物ꎮ 根据本课题组前期建 ＣＩＡ 小鼠模型根据 Ｍｉｙｏｓｈｉ 和 Ｌｉｕ(２０１８) 报道的方
立的方法( 宁德生等ꎬ２０１７ꎻＰａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎬ从 法建立:每只小鼠于尾巴根部ꎬ注射 １００ μＬ 由完
二氯甲烷提取物中制备 ２ 个主要成分厚朴酚和异 全弗氏佐剂和牛Ⅱ型胶原配制的乳剂( 含 １００ μｇ
红花八角醇ꎬ经液相鉴定纯度均大于 ９５％ꎬ它们的 牛Ⅱ型胶原)ꎬ进行初次免疫ꎻ２１ ｄ 后ꎬ每只小鼠于
ＮＭＲ 数据与宁德生等(２０１７)报道的基本一致ꎮ 尾巴根部ꎬ注射 １００ μＬ 由不完全弗氏佐剂和牛Ⅱ
１.２.２ 大鼠给药及取血 雄性 ＳＤ 大鼠适应性饲养 型胶原配制的乳剂(含 １００ μｇ 牛Ⅱ型胶原)ꎬ进行
１ 周后ꎬ随机分为空白对照组和给药组ꎬ每组 ５ 只ꎮ 增强免疫ꎮ 于加强免疫后ꎬ异红花八角醇组和甲
将二氯甲烷提取物混悬于助悬剂(４５％ 聚氧乙烯 氨蝶呤组小鼠灌胃给予指定剂量的化合物ꎬ空白
蓖麻油ꎬ４５％无水乙醇ꎬ１０％水) 中ꎬ６０ ℃ 加热助溶 对照组和 ＣＩＡ 模型组小鼠给予等剂量的生理盐
成 ０.２５ ｇｍＬ 的混悬液ꎮ 给药组大鼠灌胃上述 水ꎮ 每天一次ꎬ连续处理 ３ 周ꎮ
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混悬液ꎬ剂量为 ２.５ ｇｋｇ ꎬ空白对照组大鼠灌胃 １.２.６ 异红花八角醇抗 ＲＡ 活性检测 加强免疫
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等剂量的助悬剂ꎮ 灌胃处理 ３０、６０、９０、１２０、１８０ 后ꎬ每 ３ ｄ 对小鼠进行 １ 次关节炎指数打分ꎮ 关节
ｍｉｎ 后ꎬ从腹主动脉取血ꎬ置于含肝素钠的采血管ꎮ 炎指数为表征关节炎严重程度的指标ꎬ为四肢打
４ ０００ ｒｍｉｎ ꎬ离心 １０ ｍｉｎꎬ收集血浆ꎮ 每个时间 分相加之和ꎮ 每条肢体的打分规则如下:０ 分ꎬ正
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点取 １ ｍＬ 血浆进行混合ꎬ放－８０ ℃ 备用ꎮ 常ꎻ１ 分ꎬ单个关节肿胀ꎻ２ 分ꎬ１ 个以上关节肿胀ꎻ３
１.２.３ 血浆处理 取 ８００ μＬ 混合时间点的血浆ꎬ加 分ꎬ所有关节肿胀ꎻ４ 分ꎬ皮肤爆裂或关节扭曲( Ｌｉ
入 １ ６００ μＬ 丙 酮ꎬ 涡 旋 混 匀 ５ ｍｉｎꎮ 于 ４ ℃ ꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎮ 最后 １ 次给药 ４ ｈ 后ꎬ利用 ＣＯ 窒
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１３ ０００ ｒｍｉｎ 下离心 ２０ ｍｉｎꎮ 收集上清液ꎬ用氮 息法处死小鼠ꎬ立即通过眼眶取血ꎬ制备血清ꎬ根
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气吹干ꎬ再用 １００ μＬ ７０％的甲醇水溶液复溶ꎮ 于 据厂家说明书测定各组小鼠血清中的 ＭＣＰ￣１、ＩＬ￣６
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４ ℃ ꎬ１３ ０００ ｒｍｉｎ 下离心 ２０ ｍｉｎꎮ 收集上清液ꎬ 和 ＴＮＦ￣α 含量ꎮ 取左后肢膝关节材料ꎬ修剪整齐ꎬ
置于内存管中ꎬ待测ꎮ 经固定、脱水、透明、包埋、切片、摊片、拷片后ꎬ进
１.２.４ 液相色谱－串联质谱法检测入血成分 液相 行常规的苏木精－伊红染色( Ｈ ＆ Ｅ)ꎬ于显微镜下
色谱参数设置如下:ＯＤＳ Ｃ 色谱柱 ( １００ ｍｍ × 观察小鼠的关节病理情况ꎮ
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２.１ ｍｍꎬ ３. ５ μｍ) ꎻ 柱 温 设 为 ３０ ℃ ꎻ 流 动 相 为 １.２.７ 分子对接 首先ꎬ在 Ｐｕｂｃｈｅｍ 数据库里查找
０.１％甲 酸 ( Ａ) － 乙 腈 ( Ｂ) ꎻ 流 速 设 为 ０. ３ ｍＬ 异红花八角醇的 ２Ｄ 结构ꎬ利用 Ｃｈｅｍ３Ｄ 软件对异
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ｍｉｎ ꎻ进样 体 积 为 ２０ μＬꎮ 梯 度 洗 脱 条 件 如 下: 红花八角醇的 ２Ｄ 结构进行优化并转换成 ３Ｄ 结构ꎮ
０ ~ １０ ｍｉｎꎬ ４０％ → ７０％ Ｂꎻ １０ ~ ４０ ｍｉｎꎬ ７０％ → 其次ꎬ在 Ｕｎｉｐｏｒｔ 网站搜索 ＴＬＲ４、ＩκＢα 和 ＮＦ￣κＢ ｐ６５
９５％ Ｂꎻ４０ ~ ４５ ｍｉｎꎬ９５％ Ｂꎻ４５ ~ ５０ ｍｉｎꎬ９５％ → 等蛋白质ꎬ下载蛋白质 ３Ｄ 结构文件ꎮ 然后ꎬ利用
４０％ Ｂꎮ 质谱参数参照赵振东等( ２０１３) 的方法 ＡｕｔｏｄｏｃｋＴｏｏｌｓ 软 件 对 蛋 白 质 加 氢ꎬ 得 到 相 应 的
设定:ＥＳＩ 设为负离子模式ꎻ电压设为－３.５ ｋＶꎻ氮 ｐｄｂｑｔ 文件和 ｇｒｉｄ 文件ꎬ将 Ｓｐａｃｉｎｇ 值设置为 １ꎬ以
气作为雾化气ꎬ流量为 １.５ Ｌｍｉｎ ꎻ碰撞气为氩 Ｖｉｎａ 命令执行分子对接ꎬ获得异红花八角醇－蛋白
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气ꎻ干燥气压设为 １００ ｋＰａꎻ检测器电压设为 １.７ 质结合能ꎮ 最后ꎬ通过 Ｐｙｍｏｌ 软件去除水分子和小
ｋＶꎻ加热模块温度和 ＣＤＬ 温度均设为 ２００ ℃ ꎻ一 分子配体ꎬ然后得到成分－靶点分子对接虚拟图ꎮ
级质谱的扫描范围为质荷比( ｍ / ｚ) ３００ ~ ７００ꎻ母 １.２.８ 统计分析 在 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５.０ 软件中分
离子的扫描范围为质荷比( ｍ / ｚ) ３１５ ~ ６５０ꎻ离子 析数据ꎬ数据以平均值±标准差(ｘ±ｓ) 表示ꎬ两组间
累积时间为 １０ ｍｓꎻＣＩＤ 碰撞能量设为 １００％ꎻ碰 差异用非配对 ｔ 检验进行分析ꎬＰ<０.０５ 认为差异
撞气能量设为 １００％ꎮ 显著ꎮ
