Page 140 - 《广西植物》2020年第4期
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青(Ｎａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８) 等乔木和灌木中进行了研究 (ＶｖＡＮＲ)蛋白ꎬ将它们的亚细胞定位在细胞质和
报道ꎮ 而活体取样时ꎬ尽量选取幼嫩的叶片、根尖 细胞 核 中ꎬ 瞬时转化效率达到 ６０.１％ꎮ Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ.
等组织部位ꎬ以便充分酶解ꎬ保证原生质体的数量 (２０１８) 在芥蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃａｅ ｖａｒ. ａｌｂｏｇｌａｂｒａ) 中
和质量以进行后续试验ꎮ 分离、纯化和转化叶肉细胞的原生质体ꎬ外源基因
经过纯化的植物原生质体在数量和质量上均 的转化效率可达到 ３０％ꎮ
达到要求后ꎬ可进行下一步 实 验 应 用ꎮ 一 般 １ × ２.２ 细胞融合培育新品种
１０ ~ １×１０ 个原生质体足以进行报告酶的活性检 植物原生质体往往是原生质体融合培育新品
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测ꎻ１×１０ ~ １×１０ 个原生质体可用于蛋白标记、免 种ꎬ制造“人工种子”的优良原始材料ꎬ并且原生质
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疫共沉淀或 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹实验ꎻ大约 １×１０ 个原生 体融合技术可以完全或者部分解决自然界种属间
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质体可用于微观检测实验(Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 有性繁殖不亲和的现象ꎮ 原生质体融合技术在柑
橘的性状改良方面有着巨大潜力ꎬ通过将伏令夏
２ 植物原生质体在分子细胞生物 橙(Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ) 愈伤原生质体与叶肉细胞原生
质体进行融合ꎬ获得了稳定的二倍体“ ｃｙｂｒｉｄｓ”ꎬ胚
学中的应用
性愈伤原生质体中的线粒体 ＤＮＡ 刺激了叶肉原
生质体细胞的分化和再生(Ｃａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ Ｄｕｔｔ
２.１ 亚细胞定位检测 ｅｔ ａｌ. (２０１８) 从柑橘悬浮培养细胞中提取原生质
目前经过纯化的原生质体最广泛应用于植物 体作为初始材料ꎬ并将构建在胚中特异性表达花
亚细胞定位的检测中ꎬ常用的原生质体来源于烟 青素的基因载体(Ｄｃ３ 启动子:ＶｖＭｙｂＡ１) 转化到柑
草、拟南芥等ꎬ由于原生质体细胞圆滑完整ꎬ在显 橘原生质体中ꎬ在体细胞胚的发育过程中可以直
微镜下对于细胞结构观察非常清楚ꎬ并且排除了 接通过肉眼观察到“ 紫色胚” 来进行初步阳性筛
活体观察时细胞间以及组织部位其他结构的背景 选ꎮ Ｙｕ ｅｔ ａｌ. (２０１４) 将水稻的育性恢复基因 Ｒｆ５
干扰ꎬ结果分析具有说服力ꎮ 在植物基因功能验 转化到细胞质雄性不育( ＨＬ￣ＣＭＳ) 红莲型水稻的
证时ꎬ基本的蛋白定位即采用模式植物的原生质 原生质体中ꎬ在转化后的原生质体中检测到细胞
体进行亚细胞定位(Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎬ并且在许多 质雄性不育蛋白 ＯＲＦＨ７９ 的水平显著降低ꎮ Ｗａｎｇ
生物学背景不清楚、遗传转化体系不稳定或者效 ｅｔ ａｌ. (２０１４)将小麦和中间偃麦草( Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ ｉｎ￣
率不高的非模式植物中ꎬ也广泛进行原生质体的 ｔｅｒｍｅｄｉｕｍ)的原生质体细胞进行融合ꎬ获得渐渗系
分离、纯化和转化ꎬ如 Ｌｉ ｅｔ ａｌ. (２０１８) 在蝴蝶兰杂 群体ꎬ筛选出生命力旺盛并自花授粉可育的后代ꎮ
交种( Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ “ Ｒｕｉｌｉ Ｂｅａｕｔｙ”) 原生质体培育新品种可以打破物种的限制ꎬ但是
的叶肉原生质体中由 ＰＥＧ４０００ 介导瞬时转化绿色 培育周期较长ꎮ
荧光 蛋 白 基 因 ( ＧＦＰ)ꎬ 转 化 效 率 达 到 ４１. ７％ꎮ ２.３ 胞内生化反应的实时检测
Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ. (２０１３) 在黄瓜原生质体中瞬时表达 蛋白酶在催化底物发生细胞内生物化学反应
ｐＵＣ￣ＧＦＰ 质粒ꎬ可以在显微镜下明显观察到胞液、 时ꎬ植物原生质体是非常合适的实验材料ꎬ合理选
叶绿体和质膜上有绿色荧光ꎬ转化效率达到 ５７％ꎮ 取一些能发荧光的底物ꎬ即能在显微镜下实时观
Ｆｕ ｅｔ ａｌ. (２０１８)在玉米原生质体中ꎬ利用 ｅＧＦＰ 融 察反应的进程ꎮ Ｒｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ. (２０１８) 在研究拟
合转录因子 ＺｍＷＲＫＹ７９ 蛋白ꎬ对目的蛋白进行亚 南芥蔗糖转运蛋白时ꎬ先利用荧光蔗糖类似物 Ｅｓ￣
细胞定位ꎬ直观影像确定其位于细胞核中ꎮ Ｗａｎｇ ｃｕｌｉｎ 作为底物ꎬ将表达蔗糖转运蛋白的 ＡｔＳＵＣ 基
ｅｔ ａｌ. (２０１５)分离获得葡萄原生质体ꎬ并利用 ＧＦＰ 因转化到拟南芥原生质体中ꎬ再通过调整激光共
融合 黄 酮 类 生 物 合 成 途 径 中 的 查 尔 酮 合 成 酶 聚焦显微镜的不同激发光波段ꎬ可以实时观察到
(ＶｖＣＨＳ)、查尔酮异构酶( ＶｖＣＨＩ)、黄酮醇 ３￣Ｏ￣葡 绿色荧光蛋白、红色叶绿体自发荧光和转运到胞
萄 糖 苷 转 移 酶 ( ＶｖＵＦＧＴ ) 和 花 青 素 还 原 酶 内的湖蓝色荧光 Ｅｓｃｕｌｉｎ 分子ꎮ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ. (２０１９)
