Page 101 - 《广西植物》2020年第6期
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６ 期 梁芳等: 蝴蝶兰 ＰｈＮＡＣ１ 基因序列分析及对低温胁迫的响应 ８ ４ ７
抗冷性新品种ꎬ对于蝴蝶兰产业的健康可持续发 １.２ 方法
展具有重要意义ꎮ １.２.１ 总 ＲＮＡ 的提取和 ｃＤＮＡ 第一链的合成 各
样品总 ＲＮＡ 的提取采用多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提
１ 材料与方法 取试剂盒ꎮ 对 提 取 的 总 ＲＮＡ 经 检 测 合 格 后ꎬ 用
Ｍ￣ＭＬＶ反转录酶对其进行反转录合成单链 ｃＤＮＡ
１.１ 材料与处理 第一链ꎬ用于 ＰｈＮＡＣ１ 基因的克隆ꎻ用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
所用材料为蝴蝶兰栽培品种“ 大辣椒” ( Ｐｈａ￣ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ 试剂盒反转录成
ｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄ ‘Ｂｉｇ Ｃｈｉｌｉ’)ꎬ由郑州师范学院生物 ｃＤＮＡ 第一链ꎬ用于实时荧光定量 ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)
工程研究所提供ꎮ 两种低温处理条件:将 ５ 叶期 检测目的基因表达量ꎮ
的蝴蝶兰植株置于植物人工光照培养箱( 美国ꎬ １.２.２ ＰｈＮＡＣ１ 基因全长的扩增及 ＯＲＦ 的预测与验
ＰＥＲＣＩＶＡＬ Ｅ￣４１ＨＯ２)内 ２７ ℃ / ２２ ℃ 预培养 １５ ｄꎬ 证 利 用 ＤＮＡＭＡＮ 和 Ｐｒｉｍｅｒ ５. ０ 软 件ꎬ 以
使所有的实验苗 Ｆ / Ｆ ≥０.７９ꎮ 实验采用模拟自 ＧｅｎＢａｎｋ 中已 登 录 的 ＪＦ８３１１９８ ( 铁 皮 石 斛ꎬ Ｄｅｎ￣
ｖ
ｍ
然状态逐步降温法ꎬ分为两个阶段ꎬ第一阶段低温 ｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ)、 ＫＣ９５４５４４ ( 铁 皮 石 斛ꎬ Ｄｅｎ￣
驯化:昼夜温度 ２０ ℃ / １６ ℃ 处理 ３ ｄꎬ１６ ℃ / １１ ℃ ｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ) 和 ＡＢ２５７３１２( 蕙兰ꎬ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ
处理 ３ ｄꎻ第二阶段 １１ ℃ / ６ ℃ 低温处理 ７ ｄꎮ 其他 ｈｙｂｒｉｄ) 为模板ꎬ设计 １ 对简并引物 ＰｈＮＡＣ１￣Ｆ 和
培养条件:光暗比 １２ ｈ / １２ ｈꎬ光 强 为 ６０ μｍｏｌ ＰｈＮＡＣ１￣Ｒ(表 １)ꎬ用于扩增蝴蝶兰 ＮＡＣ 基因中间
￣２ ￣１ 保守片段ꎮ 将得到的中间保守序列经 ＢＬＡＳＴ 比对
ｍ ｓ ꎬ相对湿度 ７０％ ~ ９０％ꎮ 取样方法:以 ２７
℃ / ２２ ℃ 预培养结束取样为对照ꎬ昼夜温度 １１ ℃ / 正确 后ꎬ 分 别 设 计 １ 对 ５′端 特 异 引 物 ( ＧＳＰ５￣１、
６ ℃ 处理第 １、２、３、５、７ 天取样ꎮ 另外 ４ ℃ 低温处 ＧＳＰ５￣２) 和 ３′端特异引物( ＧＳＰ３￣１、ＧＳＰ３￣２)ꎮ 对
理ꎬ用蝴蝶兰 ３ 叶期瓶苗ꎬ置于 ４ ℃ 冰箱内分别于 中间保守区片段、５′￣ＲＡＣＥ 扩增片段和 ３′￣ＲＡＣＥ
０、０.５、１、２、４、８、１２、２４ 和 ４８ ｈ 取样ꎮ 扩增片段进行分析比对并拼接ꎬ 通过 ＢＬＡＳＴ 对得
表 １ 引物序列及用途
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ
退火温度
引物名称 序列 (５′￣３′) Ａｎｎｅａｌｉｎｇ 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｕｓｅ
(℃ )
ＰｈＮＡＣ１￣Ｆ ＴＴＣＭＧＤＴＴＣＣＡＣＣＣＮＡＣＳＧＡ ５８ 中间保守区片段的克隆
ＰｈＮＡＣ１￣Ｒ ＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＹＧＧＴＣＴＴＡＷＢＣＣＣＹＴ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ＧＳＰ５￣１ ＴＣＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡ ５６ ５′￣ＲＡＣＥ
ＧＳＰ５￣２ ＧＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＴ
ＧＳＰ３￣１ ＡＴＴＴＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣ ５６ ３′￣ＲＡＣＥ
ＧＳＰ３￣２ ＧＧＧＣＡＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＣ
ＯＲＦ￣Ｆ ＴＣＴＣＧＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＧＡＴ ５５ ＯＲＦ 的克隆 Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＯＲＦ
ＯＲＦ￣Ｒ ＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣＣ
ＰｈＮＡＣ１￣ｑＦ ＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＴ ５８ 荧光定量 ＰＣＲ 引物
ＰｈＮＡＣ１￣ｑＲ ＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＣ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＧＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＴＧＧＣ ５８ 荧光定量内参基因引物
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＧＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
到的基因全长进行同源性比对ꎬ确定得到的基因 １.２.３ ＰｈＮＡＣ１ 基因的生物信息学分析 蝴蝶兰
为 ＮＡＣ 基因ꎮ 在 ＯＲＦ 区两端设计特异引物ＯＲＦ￣Ｆ ＰｈＮＡＣ１ 基因蛋白结构域、理化性质、亲疏水性、磷
和 ＯＲＦ￣Ｒ 对 ＯＲＦ 序列进行验证ꎮ 酸化位点、以及蛋白质的二级和三级结构等采用
