Page 56 - 《广西植物》2023年第4期

ᤃ ሕ ऐ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ሕ 卷
以吐温 ԰ԡܦ吐温 ᤃԡ 及吐温 ऐԡ 为底物ྉ 添加量为 增产物进行切胶回收ᖔ采用 ᡱ᥈ᥘ᥋ϟऐఋ 载体及感受
ϟᠮɯᖔ胰蛋白胨 ϟ੫ᖔ去离子水 ϟԡԡԡ ቝᓂᖔ琼脂 ϟጢ 态大 肠 杆 菌 ఋʢᑕႿ༁ ϟԡ 对其进行克隆ᖔ 采用 引 物
੫ᤥ 脲酶筛选培养基᧥以 ሕԡᠮ尿素溶液为底物ྉ 添 ᥘϟሕèྉ ጢࣕ᥋᥈ఋఋఋఋऊऊऊዶ᥈ఋऊዶऊ᥈ዶ᥋ሕࣕɯ 和 ᥘϟሕ኏ྉ ጢࣕ᥋
加量为 ԰ᠮɯᖔ胰蛋白胨 ϟ੫ᖔશᑕऊ᤟ ጢ ੫ᖔ葡萄糖 ϟ੫ᖔ ऊዶ᥈᥈ዶዶዶऊዶ᥈ऊఋዶఋ᥈ዶ᥋ሕࣕɯ对克隆菌落进行 ۪ऊ኏ᖔ
᣽̀ ۪ᨃ ԰੫ᖔ酚红 ԡ঎ԡϟ԰ ੫ᖔ琼脂 ϟጢ ੫ ᖔ 去离子水 扩增产物进行电泳检验合格后ᖔ将阳性克隆子送
԰ ࿗
ϟ ԡԡԡ ቝᓂᖔᡱ̀ ᤃ঎ऐ ጲ ᤃ঎ँᤥ 其他参考文献进行纤维素 往上海生工生物工程ྉ上海ɯ 股份有限公司进行测
酶 ྉ 宋 朝霞等ᖔ ԰ԡϟऐ ɯܦ 几丁质酶 ྉ኏ᆍᤦᔀʢᡷ༁ ᪲ 序ᤥ 使用 ାᔽᆍጶʛᔽᡷ 及 ᧕શዶ༁ᡷᑕʢ 软件对测序结果进行
୩ᔀ᤟ᔽᡷʢᔀႿႿᔽҴᆍ஦஦ᖔϟँऐऐɯܦ淀粉酶及蛋白酶ྉ 赵雅慧等ᖔ 整理ᖔ并将其提交至 ጶԻᤦᔽᆍዹ᤟ᆍࣼʛ 序列比对平台与储
԰ԡϟऐɯ筛选培养基的配制ᤥ 存在该数据库ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ औऔऔ঎ᔀझᤦᔽᆍዹ᤟ᆍࣼʛ঎ Ⴟᔀᡷᣰ ɯ 已发
ϓॹԣ 方法 表序列进行序列比对ᖔ运用 ᥘጶ᥈ዶϟԡ঎ԡ 软件ᖔ采用
ϟ঎԰঎ϟ 样品预处理জ 植物组织᧥使用无菌水冲洗小 邻近法ྉ શᔀᔽ੫ၤᤦᆍʢ᥋ȮᆍᔽႿᔽႿ੫ɯ 法ܦ最大似然ྉᥘᑕ଴ᔽቝࣼቝ᥋
花老鼠簕各组织器官表面泥土ᖔ预处理方法ྉ李菲 ᤟ᔽҴᔀ᤟ᔽၤᆍᆍʛɯ 法构建 系 统 树ᖔ 基于 ϟԡԡԡ 次自展值
等ᖔ԰ԡϟᎮɯ对样品表面进行消毒ᖔ依次使用 ጢᠮ次氯 ྉାᆍᆍ༁ᡷʢᑕᡱ 值ɯ 分析各活性菌株的系 统 发 育 关 系

酸钠溶液浸泡 ሕቝᔽႿᖔԡ঎԰ᠮ吐温 ԰ԡ 溶液浸泡 ሕቝᔽႿᖔ ྉఋᑕቝࣼʢᑕ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟϟɯᤥ
Ꭾጢᠮ酒精浸泡 ሕቝᔽႿ 且浸泡每种消毒液后均使用无 ϟ঎԰঎࿗ 拮抗植物病原真菌活性测试জ 采用平板对
菌水冲洗样品 ሕ 次ᤥ 消毒完成后将其晾干ᖔ使用无 峙法对 ᤃ 种指示植物病原菌进行菌株拮抗测试ᤥ
菌手术刀分别将各植物组织剪成ϟዹቝ ġϟዹቝ 大小ᖔ 每 ࿗ 株可培养菌株为一组ᖔ采用点植法依次将纯
充分研磨后加入 ϟቝᓂ 无菌水制成母液ᤥ 化后的可培养菌株接种于 ۪᧕ዶ 平板四周距离边缘
根际土壤᧥取适量根际土壤样品均匀平铺于 ԰ዹቝ 处ᖔ同时使用无菌打孔器将各植物病原真菌
陶瓷蒸发皿中ᖔँԡ ቩ 热激 ሕԡ ቝᔽႿ 后称取 ϟ੫ 样品ᖔ 制成直径 ጢቝቝ 菌饼ᖔ接种于 ۪᧕ዶ 平板中心ᖔ设置
加入 ँቝᓂ 无菌水制成母液ᤥ 只接种植物病原菌的 ۪᧕ዶ 平板作为空白对照ᖔ每
ϟ঎԰঎԰ 菌株分离和纯培养জ 使用无菌水将各植物 组试验重复 ሕ 次ᖔ置于 ԰ऐ ቩ 倒置培养数天ᖔ观察
组织及根际土壤母液稀释至 ϟԡ 和 ϟԡ ᖔ分别吸取 记录菌株生长及抑制情况ᖔ计算其抑菌率ᤥ
᥋࿗
᥋ሕ
ԡ঎԰ ቝᓂ 稀释悬液涂布于 Ꭾ 种不同的分离培养基 抑菌率 ᢉ ྉ对照组植物病原真菌菌落半径ͱ处
中ᖔ԰ऐ ቩ 倒置培养 Ꭾጲ԰ऐ ʛᤥ 通过肉眼观察记录不 理组植物病原真菌菌落半径ɯᣰ 对照组植物病原真
同菌株的形态及数目ᖔ对其进行编号ᖔ并挑取不同 菌菌落半径ġϟԡԡᠮᤥ
菌落划线至改良 ᧧୩۪԰ 培养基上不断纯化直至得到 ϟ঎԰঎ጢ 捕食活性测试জ 将金黄色葡萄球菌ܦ耐甲氧
纯菌株ᤥ 将获得纯培养后的菌株接种至改良 ᧧୩۪԰ 西林金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌分别接种至
᥋ϟ
斜面培养基并放置 ࿗ቩ 保藏ᖔ同时制备 ሕԡᠮྉႬᣑ Ⴌɯ ᓂା 液体培养基ᖔ置于 ሕᎮ ቩᖔϟऐԡ ʢኼቝᔽႿ 震荡培养
甘油冻存液ᖔ挑取新鲜菌苔制成冻存管保藏于ͱऐԡ ԰࿗ ၤ 后离心去除培养基ᖔ并使用 ఋ۪ᥘ 液体培养基将
ᤃ ᥋ϟ
ቩ 冰箱中ᤥ 菌体冲洗 ሕ 次后重悬ᖔ将其稀释到 ϟԡ ऊèВኼቝᓂ ᖔ
ϟ঎԰঎ሕ ϟᤃ୩ ʢ኏શዶ 系统发育分析及菌株鉴定জ 采用 吸取 ԡ঎ሕ ቝᓂ 菌悬液均匀涂布于 ఋ۪ᥘ 琼脂平板上制
ऊၤᔀ᤟ᔀ଴᥋ϟԡԡ 法ྉ周双清等ᖔ԰ԡϟԡɯ 提取菌株 ᧕શዶᖔ取 成含有被捕食细菌的平板待用ᤥ 将可培养菌株以
ԡ঎ϟ ቝᓂ 高温灭菌的 ԰ԡᠮ树脂水溶液ᖔ无菌牙签挑 点植法接种于含有被捕食细菌的 ఋ۪ᥘ 平板上ᖔ同时
取适量纯培养菌株单菌落与其充分混合ܦ研磨ᤥ 将可培养菌株接种于不含被捕食细菌的 ఋ۪ᥘ 平板
ϟԡԡ ቩ 金属浴 ϟԡ ቝᔽႿᖔ通过离心充分沉淀 ऊၤᔀ᤟ᔀ଴᥋ 作为对照组ᖔ每组实验重复 ሕ 次ᖔ置于 ԰ऐ ቩ 恒温培
ϟԡ 颗粒ᖔ取上清作为 ۪ऊ኏ 扩增模板ᖔ参考 ۼᑕ᤟༁ၤ 养箱中培养 Ꭾʛᖔ观察并测量出现的抑菌圈直径ᤥ
等 ྉ ϟँँϟ ɯ 的方法ᖔ 扩增引物为 ԰Ꭾè ྉ ጢࣕ᥋ ϟ঎԰঎ᤃ 酶活鉴定জ 对植物病原真菌拮抗活性测试
ዶ᥈ዶ᥈ఋఋఋ᥈ዶఋऊऊఋ᥈᥈ऊఋऊዶ᥈᥋ሕࣕɯ 和 ϟጢ԰԰኏ ྉ ጢࣕ᥋ 及捕食活性测试筛选出的阳性菌株进行不同酶活
ዶዶ᥈᥈ዶ᥈᥈ఋ᥈ዶఋऊऊዶ᥈ऊऊ᥈ऊዶ᥋ሕࣕɯᖔ۪ऊ኏ 反应条件 鉴定ᤥ 使用无菌打孔器将待鉴定菌制成直径 ጢቝቝ
为᧥ँጢ ቩ 预变性 ऐቝᔽႿᖔँ࿗ቩ 变性 ϟቝᔽႿᖔጢऐቩ 退火 菌饼ᖔ并接种到不同酶活筛选培养基中ᖔ԰ऐ ቩ 倒置
࿗ጢ ༁ᖔᎮ԰ ቩ 延伸 ँԡ ༁ᖔ共进行 ሕ԰ 个循环ᤥ 将扩增产 培养 ԰ጲᎮ ʛᖔ通过观察是否出现透明圈来对活性菌
物进行 ϟᠮ琼脂糖凝胶电泳检验合格后ᖔ对阳性扩 株酶活性进行初步鉴定ᤥ