Page 105 - 《广西植物》2020年第1期
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１ 期 廖咏梅等: 香蕉植株根区土壤的真菌多样性分析 １ ０ １
病植株根区土壤样品标记为 ＸＪ１￣１ꎬ该地块的香蕉
为种植后 ６ 个月ꎬ植株尚未开花ꎬ植株周围几乎无 ２ 结果与分析
绿色杂草ꎬ但是有枯死的杂草茎叶ꎬ香蕉行间用塑
料膜覆盖防杂草及保湿土壤ꎻ地块二为三年生香 ２.１ 香蕉根区土壤总 ＤＮＡ 的 ＩＴＳ２ 区域高通量测
蕉地ꎬ健康植株根区土壤样品标记为 ＸＪ２￣０ꎬ枯萎 序数据的统计
病植株根区土壤样品标记为 ＸＪ２￣１ꎬ该地块香蕉植 对各香蕉植株根区土壤样品的总 ＤＮＡ 进行
株生长茂密ꎬ吸芽植株多ꎬ地面几乎没有杂草ꎬ但 ＩＴＳ２ 区域测序ꎬ将各样本的原始数据分别进行拼
是有较多的香蕉枯叶落叶覆盖ꎻ地块三为五年生 接、过滤ꎬ获得的数据信息见表 １ꎮ 从所获的原始
香蕉地ꎬ健康植株根区土壤样品标记为 ＸＪ３￣０ꎬ枯 序列(ｒｅａｄｓ)数量和处理后剩余 ｒｅａｄｓ 数量看出ꎬ在
萎病植株根区土壤样品标记为 ＸＪ３￣１ꎬ地面杂草 同一宿根年限的土壤样品中ꎬ健康植株所获 ｒｅａｄｓ
多ꎬ主要以三叶鬼针草( Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ) 为主ꎮ 自不 数量均多于枯萎病植株ꎬ说明健康植株根区土壤
同香蕉植株的东西南北四个方向ꎬ刮去 １ ｃｍ 表土ꎬ 的真菌种群丰度更高ꎻ在香蕉健康植株的根区土
挖开约 １５ ｃｍ 的剖面ꎬ每个剖面自上而下采集根区 壤中ꎬ随着香蕉宿根年限的增加ꎬ所获 ｒｅａｄｓ 数量
土壤样品约 ５００ ｇꎬ４ 个方向的根区土壤混合均匀 依次增加ꎬ其原因可能是随着香蕉宿根年限的增
后分成 ４ 份ꎬ取其中一份带回实验室ꎬ保存于 ４ ℃ 加ꎬ土壤被干扰程度依次降低ꎬ而使真菌的多样性
冰箱中ꎮ 依次增加ꎻ但香蕉枯萎病植株根区土壤的 ｒｅａｄｓ 数
１.２ 土壤样品的高通量测序与分析 量则没有规律性ꎬ可能原因是不同的因素导致香
从带回实验室的香蕉根区土壤样品中ꎬ每个 蕉植株生长衰弱ꎬ诱发枯萎病的发生ꎮ 根据所获
样品 称 取 约 ０. ５ ｇ 土 壤ꎬ 用 ＢｉｏＦａｓｔ 土 壤 基 因 组 序列数量绘制香农指数曲线(图 １)ꎬ从图 １ 可以看
ＤＮＡ 提取试剂盒按照其说明书提取土壤微生物基 出ꎬ所有样本均随着测序深度的增加趋向平坦ꎬ说
因组 ＤＮＡꎬ经质检合格后ꎬ送生工生物工程(上海) 明测序数据量足够ꎬ能够反映出样品中的物种组
股份有限公司ꎬ针对土壤 ＤＮＡ 中真菌的核糖体内 成特征ꎮ
转录 间 隔 区 ( Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒꎬ ＩＴＳ) 的 ２.２ ＯＴＵ 分析
ＩＴＳ２ 区域(ＩＴＳ３:５′ ＧＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＣＡ 使用 ｕｐａｒｓｅ 软 件 对 样 品 的 有 效 序 列 进 行 聚
ＧＣ ３′ꎻＩＴＳ４:５′ ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ 类ꎬ相似 性 ≥９７％ 的 ｔａｇ 聚 为 同 一 ＯＴＵｓꎬ 共 获 得
３′)进行 ＰＣＲꎬ根据 ＰＣＲ 产物浓度进行等浓度混 ３ ４１９个 ＯＴＵｓꎬ使用代表性序列与每个样品进行比
样ꎬ充分混匀后用 ２％的琼脂糖胶在 １ ×ＴＡＥ 溶液 较ꎬ将所有样品进行均一化处理之后绘制成韦恩
中电泳 ＰＣＲ 产物ꎬ割胶回收目标条带ꎬ用 Ｔｈｅｒｍｏ 图(Ｖｅｎｎ Ｇｒａｐｈ)ꎬ分析不同样品之间共有和特有
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司的 ＧｅｎｅＪＥＴ 胶回收试剂盒纯化 ＰＣＲ 的 ＯＴＵｓꎬ结果如图 ２ꎬ发现所有样品共有的 ＯＴＵｓ
产物ꎮ 使用 ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＰＣＲ￣Ｆｒｅｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ￣ 为 １９ 个ꎮ 其中ꎬ一年生香蕉健康植株根区土壤样
ａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 建库试剂盒构建文库ꎬ构建好的文库经 品(ＸＪ１￣０) 的特有的 ＯＴＵｓ ４９６ 个ꎬ而枯萎病植株
过 Ｑｕｂｉｔ 定量和文库检测ꎬ合格后ꎬ使用 ＨｉＳｅｑ２５００ 根区土壤样品( ＸＪ１￣１) 特有的 ＯＴＵｓ 为 ４０６ 个ꎬ两
进行上机测序ꎮ 者相差 １.２２ 倍ꎻ三年生香蕉健康植株根区土壤样
测序得到的原始数据( ｒａｗ ｄａｔａ)ꎬ存在一定比 品(ＸＪ２￣０) 的 ＯＴＵｓ 为 １ １５３ 个ꎬ而枯萎病植株根
例的干扰数据( ｄｉｒｔｙ ｄａｔａ)ꎮ 为了使信息分析的结 区土壤样品( ＸＪ２￣１) 特有的 ＯＴＵｓ 为 ２９７ 个ꎬ两者
果更加准确、可靠ꎬ首先对原始数据进行拼接、过 相差 ３.８８ 倍ꎻ五年生香蕉健康植株根区土壤样品
滤ꎬ得到有效数据(ｃｌｅａｎ ｄａｔａ)ꎻ然后基于有效数据 (ＸＪ３￣０)的 ＯＴＵｓ 为 ５７１ 个ꎬ而枯萎病植株根区土
进行 ＯＴＵｓ( Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔｓꎬ操作分类 壤样品( ＸＪ３￣１) 特有的 ＯＴＵｓ 为 ４７７ 个ꎬ两者相差
单位)聚类和物种分类分析ꎬ结合 ＯＴＵｓ 和物种注 １.１９ 倍ꎮ 可见ꎬ所有样品中ꎬ在同一宿根年限的香
释ꎬ得到每个样品的 ＯＴＵｓ 和分类谱系的基本分析 蕉植株中ꎬ健康植株根区土壤样品的 ＯＴＵｓ 数量均
结果ꎻ最后对 ＯＴＵｓ 进行丰度、多样性指数等分析ꎬ 大于枯萎病植株的根区土壤样品ꎬ进一步说明与
同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构 枯萎病植株相比ꎬ健康植株根区土壤的真菌种群
的统计分析ꎮ 更丰富ꎻ一年生(种植后六个月)和五年生(土壤表
