Page 139 - 《广西植物》2020年第4期

４ 期 肖政等: 植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用 ５ ７ ７

ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｕｒｖｅｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎬ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅ￣
ｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｗｅ ｈａｖｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒ￣
ｒｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ. Ｗｅ ｈａｖｅ ａｌｓｏ ａｎａ￣
ｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓꎬ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎꎬ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎꎬ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

植物原生质体是指通过酶解或者机械的方式 Ｐｉｎｄｅｌꎬ ２００７ꎻ Ｆｅｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 而沉淀法获
去除植物细胞壁所获得的细胞ꎮ 植物原生质体具 得的植物原生质体虽然数量较多ꎬ但是质量较差ꎬ

有全能性ꎬ有再分化、重新进入细胞周期、进行有 很大程度上影响后续实验结果的准确度ꎮ
丝分裂甚至分化为组织或器官的潜能( Ｅｅｃｋｈａｕｔ ｅｔ 植物原生质体的数量和密度检测一般通过在
ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 植物原生质体的结构和生理特性在 显微镜下用血球计数板进行计数ꎬ密度为每毫升
某种程度上与动物细胞的结构比较类似ꎬ经过外 １×１０ ~ １×１０ 个原生质体较适宜ꎮ 而质量检测一
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源添加物处理和外源基因转化后的植物原生质体 般通过二乙酸荧光素染色法( ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅꎬ
能迅速进行反应、代谢和反馈ꎬ缩短了实验的周 ＦＤＡ)进行鉴定ꎬＦＤＡ 可自由透过活细胞的细胞膜
期ꎬ并能帮助获得有效的体内实验数据ꎬ因此目前 并对细胞进行示踪ꎬ最大激发波长和发射波长分

被广泛应用于植物分子和细胞生物学的研究中ꎮ 别为 ４９０ 和 ５２６ ｎｍꎬ在荧光显微镜下可观察到活
不同的植物来源ꎬ原生质体的提取、纯化和包装步 细胞中呈现绿色荧光(Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ
骤大致相同ꎬ转化效率有所差别ꎬ本文将不同植物 ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 除此之外ꎬ原生质体
原生质体提取、纯化和活性检测的方法进行了概 的数量和质量控制还可以通过流式细胞术进行检
括ꎮ 并重点论述了近几年植物原生质体在分子细 测ꎮ 流式细胞术广泛应用于植物细胞 ＤＮＡ 含量
胞生物学中的应用ꎬ为利用植物原生质体进行研 和倍性分析、核型分析和辅助育种等( Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
究和育种提供了参考ꎮ ２０１８)ꎬ植物原生质体是进行流式细胞术检测的优
选试验材料ꎬ在原生质体细胞中转化进入带有荧

１ 植物原生质体的提取、纯化和 光标记的特异目的蛋白ꎬ利用流式细胞术进行分
选ꎬ后续可对其进行代谢谱或表达谱分析等( Ｂｉｒｎ￣
包装
ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５ꎻ Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ
由于原生质体失去了细胞壁ꎬ在后续实验操
植物原生质体的来源、数量和质量将很大程 作中非常容易发生破裂和凝聚ꎬ因此一些研究学
度上影响后续实验的成功与失败ꎮ 现在普遍利用 者通过各种有效的方法使原生质体固定包装ꎬ如:

酶解法提取植物原生质体ꎬ常用的酶为日本 Ｙａｋｕｌｔ 硅胶 / 藻酸盐、琼脂糖、结冷胶等ꎬ形成统一均质的
公司的纤维素酶和离析酶ꎮ 若酶浓度低ꎬ酶解时 薄层ꎬ从而利于实验操作和显微镜观察( Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
间短ꎬ则原生质体数量不够ꎻ若酶浓度和酶解时间 ２０１５)ꎮ
延长ꎬ则原生质体受到酶的毒害作用易破裂ꎬ致使 木本植物由于其生长周期长ꎬ在植物研究中

具有活力的原生质体数量减少ꎮ 利用悬浮培养细 往往处于劣势ꎬ为了缩短实验周期ꎬ保存优质种质
胞来提取原生质体ꎬ可短时间酶解得到大量具有 资源ꎬ大量具有经济价值和研究价值的木本植物
活力的原生质体(Ｒａｉｍｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 则通过快速繁殖手段获得无菌苗ꎬ以无菌苗作为
原生质体的纯化方法可 分 为 漂 浮 法 和 沉 淀 外植体分离纯化原生质体进行试验ꎬ不失为一种
法ꎬ其中常用的为漂浮法ꎬ利用 １５％ ~ ２５％的蔗糖、 研究策略ꎬ并已经在花椒( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)、椪柑
Ｐｅｒｃｏｌｌ 或 Ｆｉｃｏｌｌ 即可实现( Ｇｕｐｔａ ＆ Ｄｕｒｚａｎꎬ １９８６ꎻ (Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)、苹果( Ｆｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)、沙冬