Page 82 - 《广西植物》2020年第4期

５ ２ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
Ｍ￣ＭＬＶ逆转录酶( ＴａＫａＲａ) 合成第一链 ｃＤＮＡꎬ反 序列设计春兰 ＳＴＫ 同源基因引物( 表 １)ꎬ进行春
应体系和操作按照说明书进行ꎮ 兰 ＳＴＫ 同源基因的全长扩增ꎬ扩增程序和阳性克
１.２.２ 春兰 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因的克隆 根据 Ｇｅｎｂａｎｋ 中 隆的鉴定参考刘志雄和于先泥(２０１２) 的方法ꎮ 引
已公布的兰科植物 ＳＴＫ 同源基因的 ５′非翻译区 物合成和测序均由生工生物工程(上海) 股份有限
(５′ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎꎬ ５′ＵＴＲ) 和 ３′ＵＴＲ 的保守 公司完成ꎮ

表 １ 引物名称及序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

引物名称 序列 (５′→ ３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→ ３′) Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ＧＳＰＳＴＫ￣Ｆ ＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧ ＰＣＲ
ＣｙｇｏＳＴＫ￣Ｒ ＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＡＣＧＣＣＴＴＡＡＴＧＡＣ ＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＧＡＴＡＡ Ａｃｔｉｎ ｑＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＡＡＡＴＧ Ａｃｔｉｎ ｑＰＣＲ
ｑＣｙｇｏＳＴＫ￣Ｆ ＴＴＧＡＧＴＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧＡＡ ＣｙｇｏＳＴＫ ｑＰＣＲ
ｑＣｙｇｏＳＴＫ￣Ｒ ＴＴＧＡＧＴＣＧＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣ ＣｙｇｏＳＴＫ ｑＰＣＲ

１.２.３ ＣｙｇｏＳＴＫ 基因序列结构分析 将分离得到的 因的相对表达量按照 ２ －△△Ｃｔ 法计算ꎮ 用 ＳＰＳＳ１７.０
春兰 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因完整开放阅读框( Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ 软件对数据进行统计分析ꎮ
Ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ) 编 码 的 蛋 白 在 ＮＣＢＩ 网 页 上 执 行
ＢｌａｓｔＰ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ. ｃｇｉ) 同 ２ 结果与分析

源搜索比对ꎬ选取来自不同被子植物的 ２０ 个 ＳＴＫ
同源蛋白 ( 表 ２)ꎬ 采用 ＭＥＧＡ５. ０ 软 件 的 邻 接 法 ２.１ 两种春兰花结构的分析
(ＮＪ)构建蛋白序列的分子系统发育树ꎮ 同时ꎬ选取 普通春兰的花由 ３ 枚花萼、２ 枚花瓣、１ 枚特

拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)的 ＳＴＫ、矮牵牛(Ｐｅｔｕｎｉａ 化的唇瓣、２ 个花药构成的花粉块、１ 个合蕊柱和 １
×ｈｙｂｒｉｄａ) 的 ＦＢＰ７、ＦＢＰ１１ 和球花石斛(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ 个由 ３ 心皮合生的子房组成ꎬ其中花粉块着生于
ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ)等 ８ 个物种的 ９ 个 ＳＴＫ 同源蛋白(表 ３)ꎬ 合蕊柱上(图 １:Ａ)ꎮ 春兰‘天彭牡丹’的花结构包
用 ＢｉｏＥｄｉｔ ７.２ 软件中的 ＣｌｕｓｔａｌＷ 程序进行序列比对ꎬ 括 ４ 个花萼、花瓣 ２ 至多数、唇瓣 ２ 至多数、合蕊柱
进一步分析 ＣｙｇｏＳＴＫ 蛋白的结构域ꎮ 顶端无花粉块ꎬ子房外观形态正常(图 １:Ｂ)ꎮ
１.２.４ ＣｙｇｏＳＴＫ 基因的表达分析 在 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因 ２.２ 春兰 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因全长 ｃＤＮＡ 序列的克隆
的非保守区域中设计引物ꎬ并以春兰的 ＣｙｇｏＡｃｔｉｎ 春兰 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因 ｃＤＮＡ 序列全长 ８４９ ｂｐꎬ包

(ＧＵ１８１３５４.１)为内参基因ꎬ设计内参基因引物ꎬ 含 １ 个长 １１１ ｂｐ 的 ５′ＵＴＲꎬ１ 个长 ７０５ ｂｐ 的 ＯＲＦꎬ
检测引物的特异性后ꎬ用实时荧光定量 ＰＣＲ 技术 编码 １ 个含 ２３４ 个氨基酸残基的 ＳＴＫ￣ｌｉｋｅ 转录因

(ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲꎬ ｑＰＣＲ) 检 测 ＣｙｇｏＳＴＫ 子和 １ 个终止密码子ꎬ同时该序列还包含 １ 个长
基因在春兰不同花器官中表达的组织特异性ꎬ引 ３３ ｂｐ 的 ３′非翻译区ꎮ 命名为 ＣｙｇｏＳＴＫ( Ｇｅｎｂａｎｋ
物序列见表 １ꎮ ｑＰＣＲ 在 ＣＦＸ９６( ＢＩＯ￣ＲＡＤꎬ美国) 登录号为 ＭＨ９１７９１２.１)ꎮ 序列结构分析表明ꎬ两
荧光定量 ＰＣＲ 仪上进行ꎬ反应体系 ２０ μＬ:ＣｈａｍＱ 个品种中克隆得到的 ＣｙｇｏＳＴＫ 基因碱基序列完全
ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０ μＬꎻ上、下游引物各 ０.４ 一致ꎮ
μＬꎻｃＤＮＡ 模板 ０.４ μＬꎻｄｄＨ Ｏ ８.６ μＬꎮ 反应程序: ２.３ 蛋白同源序列比对与分子系统发生分析
２
９５ ℃ １ ｍｉｎꎻ９５ ℃ １０ ｓꎻ６０ ℃ １５ ｓꎻ４０ 个循环ꎮ 实 分子系统发生分析与进化树重建结果( 图 ２)
时荧光定量采用 ＣｈａｍＱ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试 表明ꎬＣｙｇｏＳＴＫ 转录因子与 ９ 个被子植物共 １０ 个
剂盒(购置于南京诺维赞生物科技有限公司)ꎬ基 ＳＴＫ 同源蛋白共聚于 ＳＴＫ 进化系ꎬ 是拟南芥 ＳＴＫ