Page 116 - 《广西植物》2020年第8期

８ 期 陈俊洁等: 脱落酸激素诱导拟南芥幼苗中花青素的合成 １ １ ７ １

白 ８ ｍｉｎ 进行表面灭菌ꎬ再播种在含有 ０.６％琼脂 表 １ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＲＴ￣ｑＰＣＲ
和 １％蔗糖的 １ / ２ ＭＳ 培养基上( ｐＨ ５.８)ꎬ在 ４ ℃
春化 ２４ ｈ 后置于 ２２ ℃ 的长日照条件下生长( 光 基因名称 正向引物 反向引物
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ
照 / 黑暗为 １６ ｈ / ８ ｈ)ꎮ 所用 ＡＢＡ 激素从 Ｓｉｇｍａ￣
Ａｌｄｒｉｃｈ 公 司 购 买ꎬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 购 自 Ｔａｋａｒａ ＤＦＲ ＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＧＡＡ￣ ＴＧＡＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＴＡＴ￣
ＣＡＡＧＣＡＧＣＣ ＴＣＧＧＧＧ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司ꎬ其他常用试剂购自生工生物工 ＵＦ３ＧＴ ＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣ￣ ＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＣＴＴＡＧＣＴＡ￣
ＣＧＴＡＣＡＡＴＣ ＡＣＴＣ
程(上海)股份有限公司ꎮ
ＬＤＯＸ ＣＴＧＡＴＴＣＧＡＴＴＧＴ￣ ＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＣＴＴＴ￣
１.２ ＡＢＡ 处理 ＧＡＴＧＣＡＣＡＴ ＧＧＧＧＧＴＴ
参考 Ａｎ ｅｔ ａｌ.(２０１８)的方法ꎬ将拟南芥种子播 ＭＹＢ７５ ＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡ￣ ＡＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＧ￣
ＣＡＴＴＡＣＧＣＣＣ
ＧＴＧＧＧ
￣１ ＴＴＧ１ ＴＴＣＣＴＴＣＧＡＴＴＧ￣ ＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＧ￣
种在添加不同浓度(０、０.２５、０.５、０.７５ μｍｏｌＬ )
ＧＡＡＣＧＡＴＧＴＡ ＧＣＧＴＡＴ
ＡＢＡ 的 １ / ２ ＭＳ 琼脂培养基上ꎬ４ ℃ 春化 ２４ ｈ 后置 ＴＴ８ ＡＣＴＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧ￣ ＡＴＧＡＴＴＴＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＴ￣
于长日照条件下ꎬ并在 ２２ ℃ 生长 ６ ~ １２ ｄꎬ观测幼 ＧＣＴＡＣＣＧＣ ＧＧＴＧ
ＭＹＢ９０ ＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡ￣ ＡＧＧＡＡＣＡＡＴＣＧＣＡＴ￣
苗花青素积累情况并取样用电子显微镜拍照ꎮ 每 ＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡ ＣＡＧＣＴＴＣＴ
ＭＹＢ１１３ ＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧ￣ ＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴ￣
个样品用 ＡＢＡ 处理分析的生物重复不少于 ３ 个ꎬ
ＣＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡ ＴＣＴＧＧ
且每个实验重复不少于 ３ 次ꎮ ＭＹＢ１１４ ＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡ￣ ＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴ￣
ＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡ ＴＡＣＴＣＡＧＡ
１.３ 花青素含量的测定 ＨＹ５ ＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣ ＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＣ￣
将含有 ０.２５ μｍｏｌＬ ＡＢＡ 的 １ / ２ ＭＳ 琼脂培 ＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣ ＣＴＣＡＡ
￣１
ＧＬ３ ＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＧＧＴ￣ ＣＣＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＧ￣
养基上生长的 ７ ｄ 龄的幼苗ꎬ包括野生型植株 Ｃｏｌꎬ ＴＡＡＣＡＡＴＧＴＴＧ ＧＴＴＡＡＡＣ
突变体植株 ｐａｐ１￣Ｄ、ｍｙｂ￣ＲＮＡｉ 和 ｔｔ８ 在电子天平 ＥＧＬ３ ＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧ￣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＡＧＡＧ￣
ＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡ
ＴＡＡＡＣＣＧＴＣ
取样称重 Ｗ(ｇ) 后加入 １ ｍＬ 盐酸甲醇提取物( 甲 ＰＡＬ ＣＣＡＴＡＡＧＡＴＴＧ￣ ＧＣＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴ￣
ＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＧ ＧＴＣＧＡＡ
醇 ∶ 盐酸体积比为 ９９ ∶ １)ꎬ在 ４ ℃ 条件下保持在 Ｃ４Ｈ ＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡ￣ ＣＡＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧ￣
￣１
暗处振荡 ２４ ｈꎮ １３ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎬ取浸 ＣＡＧＣＴＧＧＡＡ ＧＡＧＧＡＧＧ
４ＣＬ ＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧ￣ ＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＴＴ￣
出液分别在 ５３０、６５７ ｎｍ 波长处测量吸光度( ＯＤ ＴＡＧＣＴＣＣＧＧ ＧＡＴＴＣＴＣＴＴ
Ｆ３Ｈ ＧＣＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧ￣ ＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡ
值)ꎬ 花 色 素 苷 的 相 对 含 量 用 公 式 ( Ａ５３０￣０. ２５ ×
ＣＡＡＴＧＧＧ
Ａ６５７)ｇ ＦＷ 计算(Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 实验至少 ＴＴ２ ＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＧ￣ ＡＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣ￣
￣１
ＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣ ＣＡＡＣＴ
重复 ３ 次ꎮ
１.４ ＲＮＡ 提取和 ＲＴ￣ｑＰＣＲ
１.５ 酵母双杂交实验 (Ｙ２Ｈ)
采用 Ｈｕ ＆ Ｙｕ(２０１４)的方法所述ꎬ使用 Ｔｒｉｚｏｌ
试剂(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) 从拟南芥幼苗中提取总 ＲＮＡ 后 ＡＢＩ５ 的 ＣＤｓ 全长为１ ３２６ ｂｐꎬ编码 ４４２ 个氨
基酸ꎮ 为验证 ＡＢＩ５ 蛋白与花青素合成相关蛋白
逆 转 录 成 ｃＤＮＡ 后 进 行 定 量 实 时 ＰＣＲ ( ＲＴ￣
ｑＰＣＲ)ꎮ 第一链 ｃＤＮＡ 使用具有 ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)１８ 引物 的互作关系ꎬ将 ＡＢＩ５ 的全长序列克隆到 ｐＧＢＫＴ７
构建质粒 ＢＤ￣ＡＢＩ５ꎬ参考 Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.(２０１２)构建分
的 Ｍ￣Ｍｕ ＬＶ 逆转录酶( ＦｅｒｍｅｎｔａｓꎬＥＵ)ꎬ在 ２０ μＬ
反应体积中由 １.５ μｇ ＤＮＡ 酶处理的 ＲＮＡ 合成ꎮ 段 质 粒: ＢＤ￣ＡＢＩ５ １－１６４ 、 ＢＤ￣ＡＢＩ５ １６５－２２０ 、 ＢＤ￣
１６５－４４２ ２２１－３４９ ３５０－４４２ ꎮ 将 花
使用 ２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ 在 Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙ￣ ＡＢＩ５ 、 ＢＤ￣ＡＢＩ５ 和 ＢＤ￣ＡＢＩ５
青素合成相关促进因子的编码序列克隆到载体
ｃｌｅｒ ４８０ 实时 ＰＣＲ 仪上进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ( Ｈｕ ＆ Ｙｕꎬ
２０１４)ꎮ 拟南芥 ＡＣＴＩＮ２ 基因用作基因表达的内参 ｐＧＡＤＴ７ 中构得质粒 ＡＤ￣ＭＹＢ７５、ＡＤ￣ＭＹＢ９０、ＡＤ￣
基因ꎮ 每个样品用于 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析的生物学重复 ＭＹＢ１１３、ＡＤ￣ＭＹＢ１１４、ＡＤ￣ＴＴ８ 和 ＡＤ￣ＴＴＧ１ꎮ 参考
至少 ３ 个ꎬ且对每个生物学重复分析至少有 ２ 个技 Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ.(２０１６)的方法ꎬ分别将其分段为 Ｎ 端和 Ｃ
术重复ꎮ 用于检测转录物的基因特异性引物见 端:ＭＹＢ７５ 的第 １ ~ １２２ 个氨基酸为 Ｎ 端ꎬ第 １２３ ~

表 １ꎮ ２４９ 个氨基酸为 Ｃ 端ꎬ构建分段质粒 ＡＤ￣ＭＹＢ７５￣Ｎ