Page 129 - 《广西植物》2021年第7期
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ϟ ϟ ጢ ऐ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ϟ 卷
物科技有限公司测序ᖔ剩余质粒ͱԡ ቩ 保存ᖔ测序 白进 行 一 级结构和理化性质进行分析ଫ 采用
结果使用 ዹᆍႿᡷᔽ੫ᔀᔀᡱʢᔀ༁༁ 软件进行序列拼接ᖔ并用 ఋᥘ̀ᥘᥘ ԡ 预测蛋白跨膜结构ଫ使用 ୩ᔽ੫Ⴟᑕ۪ ጢԡ
ାᑕ༁ᡷႿ 进行序列比对ᤥ 在线预测蛋白是否含有信号肽ଫ使用 ۪ʢᆍᡷऊᆍቝᡱ ँ
ԣॹᇺ 无缝克隆构建 ᡓጛ௴ᇺԣᤇÞۗۗ 原核表达载体 预测蛋白的亚细胞定位ଫ使用 ୩ᨃ۪ᥘዶ 预测蛋白结
ሕϟ Þۗۗ 基因和 ᡱጶఋ᥋ሕᤦ 载体同源臂的引入জ 构域ଫ使用 ୩ۼ᧧୩୩᥋ᥘᨃ᧕ጶᓂ 在线软件ᖔ基于同源建
Þۗۗ 基因 ۪ऊ 反应体系᧥ᡱ᥈ᥘ᥋ఋ᥋Þۗۗ 重组质粒 模的方法ᖔ构建 Þۗۗ 的三级结构模型ᤥ
᥋ϟ
ྉϟԡԡ Ⴟ੫ኼဂᓂ ɯϟ ဂᓂᖔ引物 Þۗۗ᥋ᡱጶఋ᥋èྉϟԡ ဂቝᆍኼ 利用 ᥘጶ᥈ዶ Ꭾԡ 软件将本实验获得的 Þۗۗ
᥋ϟ
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ᓂ ɯϟጢ ဂᓂᖔ引物 Þۗۗ᥋ᡱጶఋ᥋ྉϟԡ ဂቝᆍኼᓂ ɯϟጢ 基因编码的氨基酸序列和 ᥈ᔀႿାᑕႿҴ 上收录的其他
ᗀ 植物 ᤃϟ 种植物的 Þۗۗ 基因编码的氨基酸序列进
ဂᓂᖔ۪ʢᔽቝᔀ୩ఋዶ ᥘᑕ ᧕શዶ ۪ᆍᢃቝᔀʢᑕ༁ᔀ ጢ ဂᓂᖔʛʛ̀ ᨃ
补足至 ጢԡ ဂᓂᤥ ྉ引物 Þۗۗ᥋ᡱጶఋ᥋è᧥ ዶऊ᥈ዶऊ᥈ዶऊ᥈ 行多序列比对ᖔ并构建系统发育树ᤥ
ዶऊዶዶ᥈᥈ऊ᥈ዶዶఋऊऊ᥈ዶዶऊ᥈᥈ዶ᥈ᖔ引物 Þۗۗ᥋ᡱጶఋ᥋᧥ ԣॹᣤ ᤹ᓣȣዛ 对广藿香 Þۗۗ 表达量的影响
ዶ᥈᥈᥈᥈ఋఋዶఋ᥈ऊఋዶ᥈ఋఋዶఋఋఋऊఋ᥈ఋऊఋऊఋఋ᥈ɯ ᤃϟ 材料的选取及处理জ 取 ሕԡ 株扦插半年ܦ生长
ᡱጶఋ᥋ሕᤦ 载体 ۪ऊ 反应体系᧥ᡱጶఋ᥋ሕᤦ 载体 状态良好的广藿香ᖔ搬至恒温室中培养数天以使
᥋ϟ
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ྉᤃԡ Ⴟ੫ኼဂᓂ ɯϟ ဂᓂᖔ引物 ᡱጶఋ᥋èྉ ϟԡ ဂቝᆍኼᓂ ɯ 植物适应实验环境ᖔ配制好 ԡϟԡܦԡጢ ቝቝᆍኼᓂ ᥋ϟ
᥋ϟ 茉莉酸甲酯溶液ᖔ均匀喷洒在植物叶片上ᖔ覆上保
ϟጢ ဂᓂᖔ 引物 ᡱጶఋ᥋ ྉ ϟԡ ဂቝᆍ ኼ ᓂ ɯϟ ጢ ဂᓂᖔ
ᗀ
۪ʢᔽቝᔀ୩ఋዶ ᥘᑕ ᧕શዶ ۪ᆍᢃቝᔀʢᑕ༁ᔀ ጢ ဂᓂᖔʛʛ̀ ᨃ 补 温膜 ϟၤᖔ于 ԡϟँ 年 ऐ 月 ᤃ 号 ँ 点开始取样ᖔ分别
足至 ጢԡ ဂᓂᤥ ྉ引物 ᡱጶఋ᥋è᧥᥈ዶ᥈ዶऊዶ᥈ዶዶዶఋዶዶऊఋ 于 ԡܦܦᤃܦϟܦ࿗ܦ࿗ऐܦᎮ ၤ 采摘成熟的叶片ᖔ迅速置
ዶ᥈ऊዶఋዶዶऊऊऊऊఋఋ᥈᥈ᖔᡱጶఋ᥋᧥ऊ᥈ఋఋऊ᥈᥈ዶఋఋऊ᥈ऊऊ 于液氮中速冻后放于ͱऐԡ ቩ 冰箱保存ᤥ
ఋఋ᥈ఋऊ᥈ఋऊ᥈ఋऊ᥈ఋऊ᥈᥈ఋዶऊɯ ᤃ શዶ 的提取及 ዹ᧕શዶ 第一链的合成জશዶ
Þۗۗ 基因和 ᡱጶఋ᥋ሕᤦ 载体 ۪ऊ 反应条件᧥ँጢ 提取和 ϟ 方法一致ᖔዹ᧕શዶ 第一链合成根据 ጶᆍ
ቩ 预变性 ሕቝᔽႿᖔँऐቩ 变性 ϟԡ ༁ᖔጢጢ ቩ 退火 ጢ༁ᖔᎮ ᥘ᥋ᥘᓂ ఋ 试剂盒说明书进行ᤥ
ቩ 延伸 ᤃ༁ᖔ共 ሕጢ 个循环ଫᎮ ቩ 终延伸 ጢቝᔽႿᤥ 产 ᤃሕ 引物设计及验证জ 根据广藿香 Þۗۗ 基因和
物经 ϟᠮ琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收ᖔ并检测 内参基因 ϟऐ୩ ʢશዶ 的 ቝશዶ 序列ᖔ采用 ऊቝ୩ࣼᔽᡷᔀऐ
浓度及纯度ᖔͱԡ ቩ 保存备用ᤥ 软件设计 ۪ऊ 引物ᖔ引物由擎科新业生物技术有
ሕ Þۗۗ 基因与 ᡱጶఋ᥋ሕᤦ 线性化载体的环化জ 限公司合成ᤥ ͐è۪۪୩᥋è᧥ዶ᥈᥈ఋऊऊऊఋዶዶ᥈᥈ఋఋ᥈᥈ఋዶ
按照无缝克隆试剂盒说明书对 Þۗۗ 基因和 ᡱጶఋ᥋ ఋ᥈ଫ ͐è۪۪୩᥋᧥ ᥈᥈ዶዶऊఋऊऊዶऊऊఋऊዶఋఋ᥈ዶዶऊᤥ 内
ሕᤦ 线性化载体进行环化ᖔ环化后导入 ᧕̀ጢም 感受 参基因 ϟऐ୩ 引物 ϟऐ୩᥋è᧥ ఋऊዶዶऊऊዶఋዶዶዶऊ᥈ዶఋ᥈ऊ
态细胞进行克隆ᖔ挑取单菌落小量培养后进行菌 ऊ᥈ዶऊऊଫ ϟऐ୩᥋᧥ ఋఋఋऊዶ᥈ऊऊఋఋ᥈ऊ᥈ዶऊऊዶఋዶऊఋऊऊᤥ
液 ۪ऊ 验证ᖔ阳性克隆菌株培养后提取质粒后送 验证 Þۗۗ 及内参基因使用 ϟԡ ဂᓂ 体系ᖔఋ᥋۪ऊ
测序ᤥ 测序结果拼接后与 ఋ᥋ዶ 克隆测序结果比 程序为预变性 ँऐ ቩ ᖔሕԡ ༁ଫ变性 ँऐ ቩ ᖔϟԡ ༁ଫ复性
对ᖔ同时确认目的条带插入位点是否准确ᤥ ጢሕ ቩ ᖔሕԡ ༁ଫ 延伸 Ꭾ ቩ ᖔϟ ቝᔽႿଫ 终延伸 Ꭾ ቩ ᖔ Ꭾ
ԣॹ 广藿香 Þۗۗ 蛋白的小量表达 ቝᔽႿଫ中间 ሕ 步进行 ࿗ԡ 个循环ᤥ 反应结束后使用
分别考察 ԡ ቩ 不同浓度的 ᧧۪ఋ᥈ྉϟԡܦԡᎮጢܦ ϟᠮ琼脂糖电泳进行检测ᤥ
᥋ϟ ᤃ࿗ 荧光定量 ۪ऊ 反应জ 荧光定量 ۪ऊ 反应按
ԡጢܦԡጢ ቝቝᆍኼᓂ ɯ诱导下蛋白的表达情况ᤥ
ᗀ
分别取 ጢԡ ဂᓂ 各浓度 ᧧۪ఋ᥈ 诱导得到的上清ܦ ୩ɟା ᥈ʢᔀᔀႿ۪ʢᆍ ఋᑕी̀୩ 预混型 ी۪ऊ 试剂盒的说
沉淀和对照空白菌液ᖔ加入 ϟԡ ဂᓂ ᤃġ蛋白上样缓 明书进行ᖔ样本和内参都设置了 ሕ 个平行ᖔ在 ँᤃ
冲液ᖔϟԡԡ ቩ 加热 ϟԡ ቝᔽႿᖔ取 ϟԡ ဂᓂ 样品进行电泳ᤥ 孔板中进行ᖔ以 ϟቝᓂ 无水乙醇稀释同样倍数后喷
电泳条件为 ऐԡ ᖔ ԡ ቝᔽႿଫϟԡ ᖔऐԡ ቝᔽႿᤥ 总电泳 洒于广藿香作为对照组ᤥ
时长 ϟԡԡ ቝᔽႿᤥ ᤃጢ 数据统计与分析জ 每个样品设置 ሕ 个重复ᖔ
电泳结束后使用考马斯亮蓝染色过夜ᖔ脱色 使用 ͱ᪵᪵ऊఋ 法对荧光定量的数据进行处理ᖔ基因的
ͱ᪵᪵ऊఋ ᖔ处理组和对照组的 ᪵ऊఋ ᢉ 目标基
后进行拍照ᤥ 表达量为
ԣॹጇ 广藿香 Þۗۗ 基因的生物信息学分析 因的 ऊఋ 值ͱ同一样本内参基因的 ऊఋ 值ᖔ᪵᪵ऊఋ ᢉ
采用 ጶᡱᑕ༁ᢃ 在线分析平台对 Þۗۗ 编码的蛋 处理组的 ᪵ऊఋͱ对照组的 ᪵ऊఋᖔ最后利用统计学软
