Page 39 - 《广西植物》2022年第9期
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ँ 期 雷宇阳等᧥ 走马胎三萜皂苷合成相关基因表达分析 ϟ ࿗ Ꭾ ጢ
学研究中心陈红锋研究员鉴定为报春花科紫金牛 ϓॹ ቴટዛ 的提取及 ዞᦵટዛ 文库的合成
属植物走马胎ྉዛʗʐᔠᔠᐹ ᔠᐹႥᡙᔠஏᅳᤀᔠᐹɯᤥ 走马胎的根部和叶部总 શዶ 提取按照 ጶᑕ༁ᡷᔀᡱ ᗀ
ϓॹԣ 栽培处理 ୩ࣼᡱᔀʢ 总 શዶ 提取试剂盒ྉ ᓂ୩ϟԡ࿗ԡᖔ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕɯ 建议
选取生长状况相似的走马胎苗分为 ሕ 个实验 的流程进行操作ᖔ并根据实验的效果进行适当优
组᧥水杨酸处理组ܦ茉莉酸甲酯处理组以及对照 化ᖔ延长金属浴裂解样品时间以提高提取质量ᤥ 在
组ᖔ每组各 ሕ 株作为 ሕ 次生物学重复ᤥ୩ዶ 与 ᥘᔀȮዶ 提取 后 使 用 ϟ ԡᠮ ྉ ቂᣰ Ⴌɯ 的琼脂糖凝胶电泳ᖔ
浓度皆为 ϟቝቝᆍኼᓂ ᖔ喷施叶面至有液滴滴下ᖔ每 શᑕႿᆍ۪ၤᆍᡷᆍቝᔀᡷᔀʢ 分光光度计和 ዶ੫ᔽᔀႿᡷ ϟԡԡ 生物分
᥋ϟ
天 ऐ᧥ԡԡܦϟ᧥ԡԡܦϟऐ᧥ԡԡ 各处理 ϟ 次ᖔ共处理 Ꭾʛᤥ 析仪评估总 શዶ 的质量ܦ纯度和完整性ᤥ 反转录
对照组在相同的时间里进行蒸馏水喷施处理ᤥ 经 શዶ 采用 ᥈ᆍ ୩ዹʢᔽᡱ ᔀᔀʢ༁ᔀ ఋʢᑕႿ༁ዹʢᔽᡱᡷᔽᆍႿ ᥘᔽᖔᨃᔽ੫ᆍ
过 Ꭾʛ 栽培处理之后ᖔ对 ሕ 个组分别进行统一采 ྉʛఋɯྉዶᎮँԡᖔ۪ʢᆍቝᔀ੫ᑕɯ反应体系ᖔ按照制造商建议
样ᖔ叶片采样剔除叶脉部分ᖔ根部采样只选取须根 的流程进行反转录合成 ዹ᧕શዶᤥ
部分ᖔ 把 采 集到的材料用液氮速冻后保存于 ϓॹጇ 荧光定量 ۗࣷቴ 分析
ͱऐԡ ቩ 冰箱中ᤥ 根据本课题组前期对走马胎转录组测序的结
ϓॹᇺ 三萜皂苷含量测定 果ྉᓂᔀᔽ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡɯᖔ以目前研究已鉴定与三萜皂
总三萜皂苷含量测定参考徐睿庸ྉԡԡᎮɯ 的方 苷合成各个环节相关的蛋白为对象ᖔ进行 ାᓂዶ୩ఋ۪
法并加以改进ᤥ 精密移取 ԡϟϟᤃ ቝ੫ኼቝᓂ 的齐墩 比对ᖔ获得走马胎三萜皂苷合成所涉及到的一系
᥋ϟ
果酸标准液 ϟܦܦሕܦ࿗ܦጢ ቝᓂ 蒸干溶剂后ᖔ加 ԡ ቝᓂ 列基因ᖔ分别编码的是 个 ጢ᥋二磷酸月桂酸脱羧酶
现配的 ጢᠮ香草醛ͱ冰醋酸溶液和 ԡऐ ቝᓂ 高氯酸 ྉጢ᥋ʛᔽᡱၤᆍ༁ᡱၤᆍቝᔀᑕᆍႿᑕᡷᔀ ʛᔀዹᑕʢᤦᆍᢃᑕ༁ᔀᖔ۪ᥘ᧕ᖔᥘዶ 途
溶液ᤥ 在 ऐԡ ቩ 水浴中反应 ϟጢ ቝᔽႿᖔ冰浴冷却后ᖔ 径ɯܦϟ 个 ࿗᥋羟基᥋ሕ ᥋甲基丁᥋ ᥋烯基二磷酸合成酶
各加 ጢቝᓂ 乙酸乙酯ᖔ在 ጢጢԡ Ⴟቝ 处测定吸光度ᖔ以 ྉ࿗᥋ၤᢃʛʢᆍᢃ᥋ሕ᥋ቝᔀᡷၤᢃᤦࣼᡷ᥋᥋ᔀႿᆍᢃ ʛᔽᡱၤᆍ༁ᡱၤᑕᡷᔀ ༁ᢃႿᡷၤᑕ༁ᔀᖔ
质量浓度 ྉቝ੫ኼቝᓂ ɯ 对吸光度值ྉ ዛɯ 进行线性 ̀᧕୩ᖔᥘጶ۪ 途径ɯܦϟ 个鲨烯合酶ྉ༁ीࣼᑕᔀႿᔀ ༁ᢃႿᡷၤᑕ༁ᔀᖔ
᥋ϟ
回归ᖔ得到标准曲线ᤥ ୩୩ɯܦ 个鲨烯单加氧酶 ྉ ༁ीࣼᑕᔀႿᔀ ቝᆍႿᆍᆍᢃ੫ᔀႿᑕ༁ᔀᖔ
采集各组走马胎鲜叶和鲜根ᖔ冲去泥沙ᖔ挑选 ୩ᥘɯܦ ጢ 个细胞色素 ۪࿗ጢԡ ྉ ዹᢃᡷᆍዹၤʢᆍቝᔀ ۪࿗ጢԡᖔ
并除去杂质ᖔ尽量避免水浸ᤥ 放至烘箱ᖔጢԡ ቩ 恒温 ऊɟ۪࿗ጢԡɯ家族蛋白以及 ࿗ 个尿苷二磷酸葡萄糖醛
烘干到恒重ᖔ取出后移至粉碎机ᖔ打碎后即得粗 酸基转移酶ྉ В᧕۪᥋੫ࣼዹࣼʢᆍႿᢃᡷʢᑕႿ༁ᔀʢᑕ༁ᔀᖔВ᥈ఋɯ 家族
粉ᤥ 取粗粉约 ԡ ੫ᖔ精密称定ᖔ加入 ጢԡᠮ乙醇 ጢԡ 蛋白ᖔ并以走马胎肌动蛋白基因 ᎫᐹዞᡙᔠႥ 为此次实
ቝᓂᖔ室温下超声波提取 ሕԡ ቝᔽႿྉ功率为 ࿗ԡ ۼɯᖔ过 验的内参基因ᤥ 将以上基因通过 શऊା᧧ ᨃèᔽႿʛᔀʢ
滤ᖔ滤渣与锥形瓶用 ጢԡᠮ乙醇 ԡ ቝᓂ 分数次洗涤ᖔ 工具进行开放读码框ྉᆍᡱᔀႿ ʢᔀᑕʛᔽႿ੫ ʢᑕቝᔀᖔ ᨃèɯ预
合并滤液和洗液于 ጢԡ ቝᓂ 茄形瓶中ᖔ减压回收溶 测ᖔ 利用 ାᓂዶ୩ఋ۪ 确定编码区序 列 ྉዹᆍʛᔽႿ੫
剂至无醇味ྉ 约 ϟጢ ቝᓂɯᤥ 定量转移至分液漏斗 ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀᖔ ऊ᧕୩ɯᖔ根据各个基因的 ऊ᧕୩ 序列通过
中ᖔ加入等体积水饱和石油醚ྉ 约 ጢ ቝᓂɯ 萃取 ሕ શऊା᧧ ۪ʢᔽቝᔀʢ᥋ାᓂዶ୩ఋ 进行引物设计ᤥ
次ᖔ每次振摇 ቝᔽႿᖔ静置使分层ᖔ弃去石油醚层ᖔ 利用 普 通 ۪ऊ 来 检 验 引 物的特异性以及
水层定量转移至 ጢԡ ቝᓂ 容量瓶中ᖔ用乙醇稀释至 ዹ᧕શዶ 文库的可用性ᤥ۪ऊ 的程序᧥ँጢ ቩ 变性 ጢ
刻度ᤥ 精密移取走马胎叶提取液 ԡጢ ቝᓂ 以及根提 ቝᔽႿଫँጢ ቩ ϟ ቝᔽႿᖔጢጢ ቩ ϟ ቝᔽႿᖔᎮ ቩ ϟ ቝᔽႿᖔሕԡ 个循
取液 ϟԡ ቝᓂ 于 ԡ ቝᓂ 具塞试管中ᖔ空气吹干ᖔ精确 环ଫᎮ ቩ 延伸 ጢቝᔽႿᤥ ीఋ᥋۪ऊ 的程序᧥ँጢ ቩ 预变
加入 ԡ ቝᓂ 现配的 ጢᠮ香草醛ͱ冰醋酸及 ԡऐ ቝᓂ 性 ሕԡ ༁ଫ循环反应 ँጢ ቩ ϟԡ ༁ଫᤃԡ ቩ ሕԡ ༁ᖔ࿗ԡ 个循
高氯酸ᖔ涡旋混匀ᖔऐԡ ቩ 水浴 ϟԡ ቝᔽႿᖔ紧接着进行 环ଫ熔解曲线 ँጢ ቩ ϟጢ ༁ଫᤃԡ ቩ ᤃԡ ༁ଫँጢ ቩ ϟጢ ༁ᤥ
ጢቝᔽႿ 冷却ᖔ之后加入 ጢቝᓂ 乙酸乙酯ᖔ混匀ᖔ测定 ۪ऊ 扩增在 ጶᡱᡱᔀႿʛᆍʢ ᥘᑕ༁ᡷᔀʢዹᢃዹᔀʢ ᣮጢԡၤ 上进行ᖔ
其在 ጢጢԡ Ⴟቝ 下的吸光度ᤥ ीఋ᥋۪ऊ 反应在罗氏 ᓂᔽ੫ၤᡷऊᢃዹᔀʢ ࿗ऐԡ ीఋ᥋۪ऊ 仪
᥋ϟ
三萜皂苷含量ྉቝ੫ኼ੫ ɯᢉ ྉႬɯᣰ ቂᤥ 上进行ᤥ
式中᧥ 为根据吸光度以及标准曲线算出的三 ϓॹᣤ 数据分析
᥋ϟ
萜皂苷质量浓度ྉቝ੫ኼቝᓂ ɯଫႬ 为提取液体积ଫቂ 采用 ᥘᔽዹʢᆍ༁ᆍᡷ ጶዹᔀ ԡϟᤃ 软件进行数据整理ᖔ
为样品粉末质量ᤥ 用 ᧧ାᥘ ୩۪୩୩ 软件对数据进行单因素方差分析ᤥ
