Page 54 - 《广西植物》2022年第9期
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ϟ ࿗ ँ ԡ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ 卷
购自上海爱朗仪器有限公司ଫጶᡱᆍዹၤ 酶标仪ᖔ购自 和 ࣮ ྉँᤃ ቝ੫ɯᤥ èʢ ዶͱͱϟ 置于常温下静置一段
美国 ାᔽᆍఋᔀҴ 公司ଫ薄层层析版ྉ᥈è ɯܦ柱层析硅 时间ᖔ待溶剂挥发后得到针状晶体ᖔ而后用正己烷
ጢ࿗
胶ྉԡԡ ጲ ሕԡԡ 目ɯᖔ均购自青岛凯邦ଫᨃ᧕୩ 色谱填 洗涤 ሕ 次ᖔ获得化合物 ጇྉϟᎮጢ ቝ੫ɯᤥ èʢ ዶͱͱሕ 以
料ᖔ购自日本 ɟᥘऊ 公司ଫ୩ᔀᡱၤᑕʛᔀ ᓂ̀᥋ԡᖔ购自瑞 二氯甲烷ͱ甲醇为溶剂进行重结晶ᖔ得到的晶体再
士 ᥈ጶ᥋̀ᔀᑕᡷၤዹᑕʢᔀ ାᔽᆍ᥋༁ዹᔽᔀႿዹᔀ༁ 公司ᤥ 分别用正己烷和氯仿洗涤 ሕ 次后ᖔ获得化合物 ᇺ
ϓॹᇺ 研究方法 ྉጢᎮ ቝ੫ɯᤥ èʢ ዶͱጢ 置于常温下静置一段时间ᖔ待
ϟሕϟ 发酵与提取জ 将菌株 ɟᣮ᥋ԡԡϟ 冻存管置于培 溶剂挥发后得到白色固状不溶物ᖔ而后用甲醇洗
养箱过夜活化ྉ温度 ऐ ቩ ܦ湿度 ऐԡᠮɯᖔ再将菌种 涤 ሕ 次ᖔ获得化合物 ࣽ ྉँᎮ ቝ੫ɯᤥ
接种到预先灭菌的 ۪᧕ା 培养基中摇床培养 ሕጲ࿗ ʛ ϟ ሕ ሕ ዶऊၤጶ 抑制活性测试 জ 利用文献报道的
ྉϟԡԡ ʢኼቝᔽႿ ɯᖔ待菌落孢子形成后将种子液接种 ጶቝᑕႿᆥ༁ 比色法ྉᑕࣼቝᑕႿႿ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟϟɯ对各单体
᥋ϟ
至含有 ࿗ԡԡ ቝᓂ 培养基的 ϟᓂ 锥形瓶内进行培养ᖔ 化合物的体外 ዶऊၤጶ 抑制活性进行了测定ᤥ 样品
共接种 ጢԡ 瓶ᖔ总共发酵培养 ԡ ᓂᖔ于室温下ᖔ静置 用甲醇溶解ᖔ配制成浓度为 ԡԡ ဂቝᆍኼᓂ 的溶液ᖔ
᥋ϟ
培养 ሕԡ ʛᤥ 备用ᤥ 采用倍半梯度稀释法对样品进行稀释后ᖔ
发酵液经纱布过滤ᖔ获得菌丝体和菌液ଫ其中 加入 ँᤃ 孔板中ᖔ每孔 ϟԡԡ ဂᓂᖔ待挥干后ᤥ 再依次
菌丝体用等体积的甲醇浸泡 ሕ 次ᖔ菌液则用乙酸 往每孔中加入 ᧕ᥘ୩ᨃ ϟဂᓂܦ۪ା୩ ࿗ँဂᓂܦԡ Вኼ
乙酯萃取 ሕ 次ᖔ减压浓缩ᖔ分别获得甲醇提取物与 ቝᓂ 的 ዶऊၤጶ ϟԡ ဂᓂ 和 ᧕ఋશା ԡ ဂᓂᖔ置于培养箱
᥋ϟ
乙酸乙酯提取物ᖔ将其合并后ᖔ再次将粗提取物用 ྉሕᎮ ቩ ɯ培养 ϟԡ ቝᔽႿ 后ᖔ加入 ԡ ဂᓂ 的底物 ዶఋऊ᧧ᖔ
乙酸乙酯萃取 ሕ 次ᖔ减压浓缩获得粗浸膏ᤥ 继续孵育 ԡ ቝᔽႿᤥ 最后通过酶标仪测定溶液在
ϟሕ 分离与纯化জ 将粗浸膏溶解ᖔ加入等体积的硅 چ 处的光密度值 ᦵ ᖔ每组设 ሕ 个平行ᤥ 实
࿗ԡጢ Ⴟቝ ࿗ԡጢ Ⴟቝ
胶拌样ᖔ而后通过正相硅胶柱进行初步分离ᖔ以正 验对照组᧥将 ዶऊၤጶ 酶溶液换成等体积的 ା୩ዶ 溶
己烷ܦ乙酸乙酯ܦ二氯甲烷和甲醇为洗脱剂依次洗 液ᖔ其他同实验组ᤥ 空白组᧥不加入待测样品ᖔ其
脱后ᖔ收集得到其中 ࿗ 个组分ྉèʢ ϟ ጲ èʢ ࿗ɯᤥ 各组 他同实验组ᤥ 空白对照组᧥不加入待测样品ᖔ其他
分经 ఋᓂऊ 检测后ᖔ合并 èʢ 和 èʢ ሕྉ记为 èʢ ዶɯᤥ 同实验对照组ᤥ 本实验阳性对照为盐酸多奈哌齐
对 èʢ ዶ 进行正相硅胶柱层析ᖔ用正己烷ͱ乙酸乙酯 ྉ۪ᑕᔀᑕዹࣼ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡԡɯᤥ 通过下述公式计算化合
ྉ体积比为 ँԡ ᨒ ϟԡܦ Ꭾԡ ᨒ ሕԡܦ ጢԡ ᨒ ጢԡܦ ጢ ᨒ Ꭾጢܦ 物对 ዶऊၤጶ 的抑制率后利用 ᨃʢᔽ੫ᔽႿ ँϟ 计算各单体
ԡᨒ ϟԡԡɯ梯度洗脱ᖔ收集得到 ጢ 个组分ྉèʢ ዶͱ ϟጲ 化合物的 ᧧ऊ 值ᤥ
ጢԡ
èʢ ዶͱጢɯᤥ 组分 èʢ ዶͱ࿗ 经正相硅胶柱ᖔ用二氯甲 抑制 率 ᢉ Џྉ ᦵ 空白 ͱ ᦵ 空白对照 ɯ ͱ ྉ ᦵ 实验 ͱ
烷ͱ甲醇ྉ 体积比为 ጢԡ ᨒϟܦԡ ᨒ ϟܦϟԡ ᨒϟܦጢ ᨒϟܦ ᦵ 实验对照 ɯ ᣰ ྉᦵ 空白 ͱᦵ 空白对照 ɯ ġϟԡԡᠮᤥ
ϟ ᨒ ϟܦԡ ᨒ ϟɯ梯度洗脱ᖔ收集得到 ऐ 个组分 èʢ ዶͱ࿗ͱ
ϟጲ èʢ ዶ ͱ ࿗ ͱ ऐᤥ 将组分 èʢ ዶ ͱ ࿗ ͱ ࿗ 通过半制备 জ 结果与分析
۪̀ᓂऊ 分析ᖔ流动相为甲醇ͱ水ྉ体积比为ऐጢ ᨒ ϟጢɯᖔ
᥋ϟ ԣॹϓ 菌株的鉴定
流速为 ቝᓂኼቝᔽႿ ᖔ相应获得化合物 ϓ ྉᡙ ᢉ ϟऐጢ
ቝᔽႿᖔᎮጢ ቝ੫ɯ 和 ᣤ ྉ ᡙ ᢉ ሕऐ ቝᔽႿᖔጢ ቝ੫ɯᤥ 组分 菌株 ɟᣮ᥋ԡԡϟ 经 ʢ᧕શዶ 的 ᧧ఋ୩ 序列测定ᖔ测序
èʢ ዶͱ࿗ͱጢ 通过半制备 ۪̀ᓂऊ 分析ᖔ流动相为甲醇ͱ 结果如下᧥
水ྉ体积比为 ँԡ ᨒ ϟԡɯᖔ流速为 ቝᓂኼቝᔽႿ ᖔ相应获 ऊఋఋऊऊ᥈ఋዶ᥈᥈ఋ᥈ዶዶऊऊఋ᥈ऊ᥈᥈ዶዶ᥈᥈ዶఋऊዶఋఋዶ
᥋ϟ
得化合物 ᎒ ྉᡙ ᢉ ϟऐጢ ቝᔽႿᖔሕᤃ ቝ੫ɯᤥ 组分 èʢ ዶͱሕ ऊऊ᥈ዶ᥈ఋ᥈ዶ᥈᥈᥈ऊऊऊఋऊ᥈ऊ᥈᥈ऊऊऊዶዶऊऊఋऊऊऊዶऊऊऊ
经 ୩ᔀᡱၤᑕʛᔀ ᓂ̀᥋ԡ 凝胶柱ྉ 洗脱剂为甲醇ᣰ 二氯甲 ఋఋ᥈ఋऊఋऊዶఋዶఋዶऊऊఋ᥈ఋఋ᥈ऊఋఋऊ᥈᥈ऊ᥈᥈᥈ऊऊऊዶऊऊ᥈
烷 ᢉ ϟᨒ ϟᖔ Ⴌᣑ Ⴌɯᖔ分离得到化合物 ԣ ྉᤃᤃ ቝ੫ɯᤥ 组 ᥈᥈᥈ऊऊዶऊऊఋ᥈᥈ఋऊ᥈ऊऊ᥈᥈᥈᥈᥈ዶऊ᥈ఋऊఋ᥈ఋऊऊऊऊ᥈᥈
分 èʢ ዶͱ 经硅胶柱层析ᖔ以正己烷ͱ二氯甲烷ྉ体 ᥈ऊऊऊ᥈ऊ᥈ऊऊऊ᥈ऊऊ᥈᥈ዶ᥈ऊ᥈ऊऊऊఋఋఋ᥈ዶዶऊऊऊఋ᥈ዶఋ
积比 Ꭾԡ ᨒ ሕԡܦጢԡ ᨒ ጢԡܦጢ ᨒ Ꭾጢܦԡ ᨒ ϟԡԡɯ梯度洗脱ᖔ获 ᥈ዶዶ᥈ዶఋ᥈᥈᥈ऊఋ᥈ఋऊఋ᥈ዶ᥈ఋ᥈ዶఋዶఋ᥈ዶዶዶዶఋఋ᥈ఋऊዶ
得 ࿗ 个组分 èʢ ዶͱͱϟጲ èʢ ዶͱͱ࿗ᤥ 将组分 èʢ ዶͱ ዶዶዶऊఋఋఋऊዶዶऊዶዶऊ᥈ዶዶఋऊఋऊఋఋ᥈᥈ఋఋऊऊ᥈᥈ऊዶఋऊ᥈
ͱ࿗ 经 ୩ᔀᡱၤᑕʛᔀ ᓂ̀᥋ԡ 凝胶柱ྉ 洗脱剂为甲醇ᣰ 二 ዶఋ᥈ዶዶ᥈ዶዶऊ᥈ऊዶ᥈ऊ᥈ዶዶዶఋ᥈ऊ᥈ዶఋዶዶ᥈ఋዶዶఋ᥈ఋ᥈
氯甲烷 ᢉ ϟᨒ ϟᖔ Ⴌᣑ Ⴌɯ 洗脱ᖔ获得化合物 ྉᤃ ቝ੫ɯ ዶዶఋఋ᥈ऊዶ᥈ዶዶఋఋऊऊ᥈ఋ᥈ዶዶఋऊዶఋऊ᥈ዶዶఋऊఋఋఋ᥈ዶዶ
