Page 76 - 《广西植物》2023年第11期
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二氯甲烷 - 甲醇( 100 ∶ 0 ~ 0 ∶ 100ꎬV / V) 梯度洗 产物序列的结果见表 1ꎮ 由表 1 可知ꎬ16 株内生真
脱ꎬ根据薄层色谱分析结果合并ꎬ得到 4 个组分 菌分属 2 纲 7 目 10 科 10 属ꎬ镰刀属(Fusarium)为
(Fr. 1 ~ Fr. 4)ꎮ Fr. 2 运用反相色谱柱分离ꎬ甲醇- 优势菌属ꎬ占鉴定菌株的 25%ꎮ 选取同源性较高
水(30 ∶ 70 ~ 70 ∶ 30ꎬV / V)梯度洗脱得到 Fr.2.1 ~ 的相似菌株序列以 Neighbor ̄Joining 法聚类构建系
2.4 组分ꎮ Fr. 2.1 经过两次硅胶柱层析分离得到 统发育树( 图 1)ꎬ16 株内生真菌均与相似菌株构
化合物 5 ( 40. 0 mg)ꎮ Fr. 2. 2 经反相色 谱 柱 ( 甲 成了末端聚类且支持率大于 50%ꎮ
醇-水 30 ∶ 70 ~ 70 ∶ 30ꎬV / V) 梯度分离ꎬ再运用
HPLC 制备(乙腈-水 25 ∶ 75ꎬV / V) 得到化合物 7 表 1 桐花树内生真菌 ITS 序列在
(184.4 mg)ꎮ Fr. 2.3 经凝胶柱脱色后ꎬ再经 HPLC GenBank 数据库比对结果
Table 1 Matching results in GenBank database of ITS
制备(乙腈 - 水 55 ∶ 45ꎬV / V) 得 到 化 合 物 1 ( 7. 6
mg)ꎮ Fr. 2. 4 经 反 相 色 谱 柱 分 离ꎬ 甲 醇 - 水 sequence of endophytic fungi derived
from Aegiceras corniculatum
(80 ∶ 20ꎬ V / V) 等 度 洗 脱 得 到 组 分 Fr. 2. 4A 和
Fr. 2.4Bꎮ Fr. 2.4A 经凝胶柱分离和 HPLC 制备 菌株编号 相似菌种 登记号 相似度
Similar strain Accession Identity
(乙腈-水60 ∶ 40ꎬV / V)得到化合物 3(11.3 mg) 和 Strain code species number (%)
化合物 2(293.5 mg)ꎻFr. 2.4B 经 HPLC 制备( 乙 GXIMD02028 Fusarium incarnatum MT560229 99.61
腈-水70 ∶ 30ꎬV / V)得到化合物 4(13.6 mg)ꎮ Fr.3 GXIMD02029 Phomopsis asparagi MN089629 96.57
经凝胶柱纯化ꎬ再经 HPLC 制备(乙腈-水 70 ∶ 30ꎬ GXIMD02030 Fusarium sp. MF398836 99.05
V / V)得到化合物 6(67.7 mg)ꎮ GXIMD02031 Colletotrichum fructicola MK041484 98.90
1. 2. 5 单 体 化 合 物 的 最 低 抑 菌 浓 度 ( minimal GXIMD02032 Phyllosticta capitalensis MG954332 99.83
inhibitory concentrationꎬMIC) 测定 单体化合物溶 GXIMD02033 Colletotrichum gloeosporioides MN298754 98.90
 ̄1
解在 DMSO 中ꎬ初始浓度为 10 mgmL 的溶液ꎮ GXIMD02034 Fusarium incarnatum MN871560 99.61
阳性对照为氨苄青霉素钠和环丙沙星配成 1 mg GXIMD02035 Phyllosticta sp. KX065279 100
 ̄1
mL 的 DMSO 溶液ꎮ 指示菌接种于 LB 培养基ꎬ37
GXIMD02036 Amorocoelophoma sp. MT112305 98.80
6
℃ 下振荡培养至对数期ꎬ调节菌悬液 10 CFU
GXIMD02037 Diaporthe caulivora MT197383 98.36
mL ꎮ 96 孔板的第 1 列加入 190 μL LB 液体培养
 ̄1
GXIMD02038 Fusarium proliferatum MT734054 99.42
基和 10 μL 样品ꎬ第 2 至第 9 列每孔加入 100 μL
GXIMD02039 Curvularia oryzae MN180224 98.39
LB 液体培养基ꎮ 第 1 列混合均匀后ꎬ取 100 μL 培
GXIMD02040 Muyocopron laterale MT658037 99.30
养液到第 2 列ꎬ倍比稀释至第 8 列ꎮ 第 1 至第 8 列
GXIMD02041 Sporormiaceae sp. KX065284 100
每孔加入 100 μL 菌液ꎬ第 9 列不加菌液作为阴性
GXIMD02042 Diaporthe australiana MN708224 97.03
对照ꎬ第 10 列每孔加入 100 μL LB 培养液和 100
GXIMD02043 Nigrospora oryzae MK131325 99.04
μL 菌液作空白对照ꎮ 单体化合物的终浓度依次
为 250、 125、 62. 5、 31. 25、 15. 625、 7.812 5、
3.906 25、1.953 125 μg mL ꎬ 每 个 浓 度 设 3 复 2.2 活性菌株筛选结果
 ̄1
孔ꎬ实验重复 3 次ꎮ 37 ℃ 恒温培养 24 hꎬ观察实验 菌 株 发 酵 产 物 抑 菌 结 果 见 表 2ꎬ 菌 株
结果ꎬ若孔内澄清ꎬ说明小孔内细菌生长被抑制ꎬ GXIMD02029 和 GXIMD02039 的发酵产物对枯草
对应澄清孔的最小浓度值为化合物的 MIC 值ꎮ 芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄
球菌、藤黄微球菌、粘性放线菌和金黄色葡萄球菌
2 结果与分析 有不同程度的抑制作用ꎻ菌株 GXIMD02038 的发
酵产物对藤黄微球菌、粘性放线菌和金黄色葡萄
2.1 菌株鉴定结果 球菌有一定的抑制作用ꎻ其他菌株发酵产物未显
根据菌落形态、颜色特征排重后ꎬ选取 16 株 示抑菌活性ꎮ 所有菌株发酵产物对铜绿假单胞
内生真菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增ꎬ获得 500 ~ 菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌均未
600 bp 的单一片段碱基对ꎮ 基于 BLAST 比对扩增 显示抑制作用ꎮ