Page 76 - 《广西植物》2023年第11期
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2 0 3 6                                广  西  植  物                                         43 卷
            二氯甲烷 - 甲醇( 100 ∶ 0 ~ 0 ∶ 100ꎬV / V) 梯度洗            产物序列的结果见表 1ꎮ 由表 1 可知ꎬ16 株内生真
            脱ꎬ根据薄层色谱分析结果合并ꎬ得到 4 个组分                            菌分属 2 纲 7 目 10 科 10 属ꎬ镰刀属(Fusarium)为
            (Fr. 1 ~ Fr. 4)ꎮ Fr. 2 运用反相色谱柱分离ꎬ甲醇-               优势菌属ꎬ占鉴定菌株的 25%ꎮ 选取同源性较高
            水(30 ∶ 70 ~ 70 ∶ 30ꎬV / V)梯度洗脱得到 Fr.2.1 ~          的相似菌株序列以 Neighbor ̄Joining 法聚类构建系
            2.4 组分ꎮ Fr. 2.1 经过两次硅胶柱层析分离得到                      统发育树( 图 1)ꎬ16 株内生真菌均与相似菌株构
            化合物 5 ( 40. 0 mg)ꎮ Fr. 2. 2 经反相色 谱 柱 ( 甲           成了末端聚类且支持率大于 50%ꎮ
            醇-水 30 ∶ 70 ~ 70 ∶ 30ꎬV / V) 梯度分离ꎬ再运用
            HPLC 制备(乙腈-水 25 ∶ 75ꎬV / V) 得到化合物 7                       表 1  桐花树内生真菌 ITS 序列在

            (184.4 mg)ꎮ Fr. 2.3 经凝胶柱脱色后ꎬ再经 HPLC                           GenBank 数据库比对结果
                                                               Table 1  Matching results in GenBank database of ITS
            制备(乙腈 - 水 55 ∶ 45ꎬV / V) 得 到 化 合 物 1 ( 7. 6
            mg)ꎮ Fr. 2. 4 经 反 相 色 谱 柱 分 离ꎬ 甲 醇 - 水                     sequence of endophytic fungi derived
                                                                           from Aegiceras corniculatum
            (80 ∶ 20ꎬ V / V) 等 度 洗 脱 得 到 组 分 Fr. 2. 4A 和
            Fr. 2.4Bꎮ Fr. 2.4A 经凝胶柱分离和 HPLC 制备                  菌株编号           相似菌种            登记号      相似度
                                                                              Similar strain   Accession  Identity
            (乙腈-水60 ∶ 40ꎬV / V)得到化合物 3(11.3 mg) 和               Strain code     species        number   (%)
            化合物 2(293.5 mg)ꎻFr. 2.4B 经 HPLC 制备( 乙              GXIMD02028   Fusarium incarnatum  MT560229  99.61
            腈-水70 ∶ 30ꎬV / V)得到化合物 4(13.6 mg)ꎮ Fr.3            GXIMD02029   Phomopsis asparagi  MN089629  96.57
            经凝胶柱纯化ꎬ再经 HPLC 制备(乙腈-水 70 ∶ 30ꎬ                    GXIMD02030     Fusarium sp.    MF398836  99.05
            V / V)得到化合物 6(67.7 mg)ꎮ                            GXIMD02031  Colletotrichum fructicola  MK041484  98.90
            1. 2. 5 单 体 化 合 物 的 最 低 抑 菌 浓 度 ( minimal          GXIMD02032  Phyllosticta capitalensis  MG954332  99.83
            inhibitory concentrationꎬMIC) 测定  单体化合物溶           GXIMD02033 Colletotrichum gloeosporioides  MN298754  98.90
                                                  ̄1
            解在 DMSO 中ꎬ初始浓度为 10 mgmL 的溶液ꎮ                     GXIMD02034   Fusarium incarnatum  MN871560  99.61
            阳性对照为氨苄青霉素钠和环丙沙星配成 1 mg                          GXIMD02035     Phyllosticta sp.  KX065279  100
                ̄1
            mL 的 DMSO 溶液ꎮ 指示菌接种于 LB 培养基ꎬ37
                                                               GXIMD02036   Amorocoelophoma sp.  MT112305  98.80
                                                   6
            ℃ 下振荡培养至对数期ꎬ调节菌悬液 10 CFU
                                                               GXIMD02037     Diaporthe caulivora  MT197383  98.36
            mL ꎮ 96 孔板的第 1 列加入 190 μL LB 液体培养
                ̄1
                                                               GXIMD02038   Fusarium proliferatum  MT734054  99.42
            基和 10 μL 样品ꎬ第 2 至第 9 列每孔加入 100 μL
                                                               GXIMD02039    Curvularia oryzae  MN180224  98.39
            LB 液体培养基ꎮ 第 1 列混合均匀后ꎬ取 100 μL 培
                                                               GXIMD02040   Muyocopron laterale  MT658037  99.30
            养液到第 2 列ꎬ倍比稀释至第 8 列ꎮ 第 1 至第 8 列
                                                               GXIMD02041    Sporormiaceae sp.  KX065284  100
            每孔加入 100 μL 菌液ꎬ第 9 列不加菌液作为阴性
                                                               GXIMD02042   Diaporthe australiana  MN708224  97.03
            对照ꎬ第 10 列每孔加入 100 μL LB 培养液和 100
                                                               GXIMD02043    Nigrospora oryzae  MK131325  99.04
            μL 菌液作空白对照ꎮ 单体化合物的终浓度依次
            为 250、 125、 62. 5、 31. 25、 15. 625、 7.812 5、
            3.906 25、1.953 125 μg  mL ꎬ 每 个 浓 度 设 3 复        2.2 活性菌株筛选结果
                                        ̄1
            孔ꎬ实验重复 3 次ꎮ 37 ℃ 恒温培养 24 hꎬ观察实验                        菌 株 发 酵 产 物 抑 菌 结 果 见 表 2ꎬ 菌 株
            结果ꎬ若孔内澄清ꎬ说明小孔内细菌生长被抑制ꎬ                             GXIMD02029 和 GXIMD02039 的发酵产物对枯草
            对应澄清孔的最小浓度值为化合物的 MIC 值ꎮ                            芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄
                                                               球菌、藤黄微球菌、粘性放线菌和金黄色葡萄球菌
            2  结果与分析                                           有不同程度的抑制作用ꎻ菌株 GXIMD02038 的发
                                                               酵产物对藤黄微球菌、粘性放线菌和金黄色葡萄
            2.1 菌株鉴定结果                                         球菌有一定的抑制作用ꎻ其他菌株发酵产物未显
                 根据菌落形态、颜色特征排重后ꎬ选取 16 株                        示抑菌活性ꎮ 所有菌株发酵产物对铜绿假单胞
            内生真菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增ꎬ获得 500 ~                     菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌均未
            600 bp 的单一片段碱基对ꎮ 基于 BLAST 比对扩增                     显示抑制作用ꎮ
   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81