Page 27 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 张丽芳等: 火棘不同组织内生细菌群落多样性 １ １ ９ ５
ｍｉｎꎬ再用无菌水冲洗 ３ ~ ４ 次ꎬ最后一遍无菌水洗 量ꎮ 但图 ２ 中 Ｓｈａｎｎｏｎ 稀释曲线显示ꎬ随着测序
涤液经涂布牛肉膏蛋白胨培养基检测ꎬ确认无菌 ｒｅａｄｓ 数量增加ꎬ火棘根茎叶内生菌 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数
后ꎬ对样品内生菌基因组 ＤＮＡ 进行提取( 李亮亮ꎬ 已趋于平缓ꎬ说明增加测序量并不会增加样本的
２０２１)ꎮ ＯＴＵ 数量ꎮ 因此ꎬ基于现有测序数据得到的分析
１.４ 基因组 ＤＮＡ 的提取及扩增测序 结果准确可靠ꎮ
采用 ＦａｓｔＤＮＡＳｐｉｎｋｉｔ( ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ) 试 剂 盒 ２.２ 火棘不同组织内生细菌 ＯＴＵ 聚类及其多样性分析
对火棘不同组织样本进行总 ＤＮＡ 的提取ꎬ经 １％ 由图 ３ 可知ꎬ通过对火棘不同组织内生细菌进
琼脂糖凝胶电泳检测所提取 ＤＮＡ 的纯度和浓度 行高通量测序并进行 ＯＴＵ 聚类分析后共得到 ＯＴＵ
后ꎬ送至 上 海 美 吉 生 物 医 药 科 技 有 限 公 司 进 行 数１ ８１８个ꎬ其中ꎬ根的 ＯＴＵ 数为 ７５４ 个ꎬ茎为 ３０８
ＰＣＲ 扩增和高通量测序ꎮ 本研究选用引物 ７９９Ｆ 个ꎬ叶为 ７５６ 个ꎬ火棘的根、茎、叶共有的 ＯＴＵ 数为
( ５′￣ＡＡＣＭＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＫＧ￣３′) / １３９２Ｒ ( ５′￣ １５２ 个ꎬ其中ꎬ茎、叶共有 ５４ 个ꎬ根、叶共有 ２５６ 个ꎬ
ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ￣３′)和 ７９９Ｆ(５′￣ＡＡＣＭＧＧＡＴ 根、茎共有 ２３ 个ꎮ
ＴＡＧＡＴＡＣＣＣＫＧ￣３′) / １１９３Ｒ(５′￣ＡＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣ 通过对火棘不同组织内生细菌进行高通量测
ＣＴＴＣＣ￣３′)ꎬ该引物可在一定程度上避免寄主植物 序后ꎬ由表 １ 可知ꎬ不同组织内生菌有效序列条数
叶绿体 和 线 粒 体 的 污 染 ( Ｂｕｌｇａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ 不同ꎬ 分 别 为 根４１ ９４８ 条、 茎３７ １８０ 条、 叶 ４０ ９９６
Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｂｕｌｇａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 通 条ꎬ基于 ＯＴＵ 水平对不同组织内生菌进行 Ａｌｐｈａ
过 ＰＣＲ 对火棘内生菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ５ ~ Ｖ７ 可变区进 多 样 性 指 数 进 行 分 析ꎬ 其 中 Ｓｈａｎｎｏｎ 指 数 和
行扩增ꎮ ２０ μＬ ＰＣＲ 反应体系为 ４ μＬ ５ ×ＦａｓｔＰｆｕ Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数表示群落多样性ꎬＳｈａｎｎｏｎ 指数越高ꎬ
￣１
Ｂｕｆｆｅｒꎬ２ μＬ ｄＮＴＰｓ ( ２. ５ ｍｍｏｌ Ｌ )ꎬ ０. ８ μＬ ５ Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数越低表明内生细菌群落多样性越高ꎬ
￣１ Ｃｈａｏ１ 指数和 Ａｃｅ 指数表示群落丰富度ꎬ指数值越
μｍｏｌＬ 上下游引物ꎬ０.４ μＬ ＦａｓｔＰｕ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ
￣１ ＤＮＡ 模 板ꎬ ０. ２ μＬ ＢＳＡꎬ 用 高ꎬ说明群落丰富度越大ꎮ 由表 １ 可知ꎬ火棘不同
１ μＬ １０ ｎｇ μＬ
ｄｄ Ｈ Ｏ补充至 ２０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件:９５ ℃ 预变 组织内生菌群落多样性和丰富度存在差异ꎬ根部
２
性 ３ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延 内生细 菌 的 多 样 性 和 丰 富 度 最 高ꎬ 茎 部 和 叶 部
伸 ４５ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎ 后 ４ ℃ 保存ꎮ 次之ꎮ
扩增产物用 １％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ利用高通 ２.３ 火棘不同组织内生细菌种群归类分析
量技术进行测序ꎮ 对火棘根、茎、叶不同组织内生细菌物种分类
１.５ 数据分析 阶层统计分析ꎬ火棘不同组织内生细菌一共可归
测序完成后ꎬ使用 Ｆｌａｓｈ 软件对序列进行拼接 类为 ２９ 个门、７１ 个纲、１７５ 个目、２８９ 个科和 ５３３
并筛选有效序列ꎬ然后使用 Ｕｐａｒｓｅ 软件进行 ＯＴＵ 个属和 ８５２ 个种ꎮ 火棘不同组织内生细菌的分类
聚类ꎮ 通过 Ｍｏｔｈｕｒ 和 ＰＩＣＲＵＳｔ 等软件对内生细菌 阶层存在较大差别ꎮ 由表 ２ 可知ꎬ其根部和叶部
进行 Ａｌｐｈａ 多样性分析ꎬ代谢功能预测分析ꎬ从而 的内生细菌多样性最为丰富ꎬ茎部次之ꎮ
获得火棘不同组织内生细菌功能相关信息ꎮ ２.４ 火棘不同组织内生细菌群落组成及差异分析
２.４.１ 火棘不同组织内生细菌门水平群落组成分
２ 结果与分析 析 由图 ４ 可知ꎬ所测 ３ 组不同组织样品中丰度较
高的群落为变形菌门( Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)、厚壁菌门
２.１ 火棘不同组织样品稀释曲线分析 (Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ)、放线菌门( Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ)ꎬ不同组织
图 １ 和图 ２ 反映了样品测序深度ꎬ检验本次 中优势细菌门丰度差异很大ꎬ其中根中为５９.１２％
测序结果是否真实准确地覆盖整个类群ꎬ图中横 变形菌门、５.２５％厚壁菌门和 ３０.３５％放线菌门ꎬ优
坐标表示样品 ｒｅａｄｓ 数量ꎬ纵坐标表示 ＯＴＵ 水平 势菌门为变形菌门和放线菌门ꎻ茎中为 ６８.１５％变
多样性指数ꎮ 由图 １ 可知ꎬ随着测序 ｒｅａｄｓ 数量 形菌门、１９.７４％厚壁菌门和 ９.３２％放线菌门ꎬ优势
增加ꎬ火棘 根 茎 叶 内 生 菌 Ｓｏｂｓ 指 数 有 微 上 升 趋 菌门为变形菌门和厚壁菌门ꎻ叶中为 ４８.１４％ 变形
势ꎬ表明火棘叶中仍有部分内生群落的种群尚未 菌门、３１.５６％厚壁菌门和 １４.２６％放线菌门ꎬ优势
被检测ꎬ 若 增 加 测 序 量ꎬ 会 增 加 样 本 的 ＯＴＵ 数 菌门为变形菌门和厚壁菌门ꎮ
