Page 70 - 《广西植物》2023年第7期

１ ２ ３ ８ 广 西 植 物 ４３ 卷
菌和沙门氏菌为指示菌ꎬ筛选具有抑制革兰氏阴 比对鉴定(Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎬ根据序列的相似度
性、阳性两类细菌活性的内生真菌类群ꎬ为研发新 和覆盖率ꎬ结合菌株形态学特征确定各分离菌株
型天然抑菌药物提供候选菌株ꎬ也为光枝勾儿茶 归 属ꎬ 并 根 据 ＭｙｃｏＢａｎｋ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｍｙｃｏｂａｎｋ.
进一步开发应用奠定研究基础ꎮ ｏｒｇ / ｑｕｉｃｋｓｅａｒｃｈ.ａｓｐｘ)官网查询确认最新的内生真
菌分类地位ꎮ
１ 材料与方法 １.５ 数据统计及多样性分析
通过数据统计ꎬ根据多样性评价指标ꎬ采用分
１.１ 植物材料 离 率 ( ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬ ＩＲ )、 分 离 频 率 ( ｉｓｏｌａｔｉｏｎ

分别采集贵州省贵阳市龙洞堡(１０６°４７′２６″ Ｅꎬ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙꎬ ＩＦ)、卡马戈指数( Ｃａｍａｒｇｏ’ ｓ ｉｎｄｅｘ)、香
２６°３１′４９″ Ｎꎬ海拔 １ １００ ｍ)ꎬ黔西市(１０５°４９′０４″ Ｅꎬ 农 － 维 纳 多 样 性 指 数 ( Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｅｉｎｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
２７°０４′００″ Ｎꎬ海拔 １ ３３０ ｍ)健康光枝勾儿茶样本 １１ ｉｎｄｅｘꎬ Ｈ′)、辛普森指数(Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ ｉｎｄｅｘꎬ Ｄ)及索
株ꎬ其中贵阳 ６ 株、黔西 ５ 株ꎬ将采集的光枝勾儿茶 伦森相似性指数( Ｓｏｒｅｎｓｏｎ’ ｓ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬ
植株放入采样袋带回实验室ꎬ２４ ｈ 内进行内生真菌 Ｃｓ)分析光枝勾儿茶植物内生真菌的多样性ꎮ
分离培养ꎮ 植株经中山大学植物学廖文波教授鉴 １.６ 内生真菌体外抗菌活性筛选
定为鼠李科植物光枝勾儿茶( Ｂｅｒｃｈｅｍｉａ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ １.６.１ 菌株的选择及发酵产物制备 根据鉴定结
ｖａｒ. ｌｅｉｏｃｌａｄａ)ꎮ 果ꎬ选择 分 布 于 不 同 属 的 ２３ 株 分 离 菌ꎬ 分 别 为
１.２ 测试菌株 ＱＸ４Ｇ６、 ＱＸ３Ｙ２￣５、 ＱＸ５Ｙ４￣３、 ＱＸ３Ｊ３￣３、 ＱＸ１Ｙ１￣１、
大肠杆菌( Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２) 标准 ＱＸ３Ｙ３￣１、ＱＸ３Ｊ３￣５、ＱＸ１Ｇ１￣３、ＱＸ５Ｇ２￣１、ＱＸ３Ｊ４￣１、
株、沙门氏菌( Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ＡＴＣＣ １３０７６) 标 Ｇ２Ｓ１２、 Ｇ２Ｓ２０、 Ｇ２Ｌ１７、 Ｄ２Ｓ３１、 Ｇ３Ｆ４、 Ｄ２Ｓ１０、
准株、金黄色葡萄球菌( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ Ｄ２Ｓ２５、 Ｄ２Ｓ２４、 Ｄ３Ｆ３、 Ｇ２Ｓ１、 Ｇ２Ｓ１１、 Ｄ１Ｓ１６ 和
６５３８)标准株购自中国微生物菌种保藏中心ꎮ Ｇ３Ｌ５ꎬ采用 ＰＤＡ 活化ꎬ待菌丝长满平板后ꎬ切成小
１.３ 内生真菌的分离纯化 块ꎬ接种于 ＰＤＢ 培养基ꎬ于 ２８ ℃ ꎬ１２０ ｒｍｉｎ 振
￣１
将采集到的光枝勾儿茶样本冲洗干净并自然 荡培养 ７ ｄ 后ꎬ静置培养 ３０ ｄꎬ发酵培养物用等体
晾干ꎬ用无菌去离子水反复冲洗ꎬ无菌滤纸吸干水 积乙酸乙酯萃取 ３ 次ꎬ合并萃取液ꎬ经旋蒸、干燥
￣１
分ꎬ置于 ０.１％吐温 ８０ 溶液中浸泡活化 ３ ~ ５ ｍｉｎꎬ 后ꎬ加入 ＭＨ 培养基稀释至浓度为 ２００ ｍｇｍＬ 的
无菌水冲洗ꎬ无菌滤纸将水分吸干后于 ７５％乙醇 母液备用ꎮ
中浸泡 ３ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗ꎬ用无菌滤纸吸干表面 １.６.２ 菌液制备 将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色
水分ꎮ 采用 ７０％乙醇＋３％ Ｈ Ｏ 混合液消毒ꎬ无菌 葡萄球菌接种于 ＭＨ 固体培养基上划线活化ꎬ置
２ ２
水冲洗 ３ 次ꎬ无菌滤纸吸干ꎬ将叶、根、茎和果实剪 于 ３７ ℃ 培养 １８ ｈꎬ挑取单个菌落于含 ＭＨ 液体培
￣１
成小组织块(０.５ ｃｍ × ０.５ ｃｍ)ꎬ接种于含氯霉素 养基的试管中ꎬ置于 ３７ ℃ 、１２０ ｒｍｉｎ 条件下振
(终浓度为 ２０ μｇｍＬ ) 的 ＰＤＡ 平板内ꎬ２８ ℃ 恒 荡培养 １２ ｈꎮ 用 ＭＨ 液体培养基调整菌液 ＯＤ 为
￣１
６００
温培养ꎮ 为验证表面消毒是否有效ꎬ将表面消毒 ０.８ 后 稀 释 １ ０００ 倍ꎬ 使 菌 液 浓 度 为 １０ ~ １０ ６
５
组织接种于含氯霉素 ＰＤＡ 培养基上印记ꎬ同等条 ＣＦＵｍＬ ꎬ备用ꎮ
￣１
件下恒温培养ꎬ印记部位未见真菌生长则确认消 １. ６. ３ 最 小 抑 菌 浓 度 ( ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
毒彻 底 ( Ｓａｎｃｈｅｚ￣Ｍａｒｏｕｅｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ 随 时 观 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬ ＭＩＣ ) 的 测 定 参 考 Ｂａｌｏｕｉｒｉ 等
察ꎬ组织块边缘有菌丝长出时ꎬ采用针尖端菌丝挑 (２０１６)的方法ꎬ采用微量肉汤二倍稀释法ꎬ于无菌
取法ꎬ将菌丝转接于新的 ＰＤＡ 平板ꎬ直至纯化获得 ９６ 孔板每孔中各加入 １００ μＬ 肉汤培养基ꎬ分别向
形态均一菌落进行鉴定及保存ꎮ 分离过程中详细 第 １ 孔中加入 １００ μＬ 配备好的药液ꎬ混匀后依次倍
记录组织块及分离菌株数量ꎮ 比稀释ꎬ直到第 ９ 孔混匀后弃去 １００ μＬ 混合液ꎮ 每
１.４ 内生真菌的鉴定 孔加入上述配备好的 １００ μＬ 细菌溶液ꎮ 每板设置
纯化后的菌株参照« 真菌学鉴定手册» ( 魏景 无药和空白对照组ꎬ观察细菌生长情况ꎬ３７ ℃ 恒温
超ꎬ１９７９)ꎬ从形态学上初步判定菌株分类学地位ꎮ 培养 １８ ｈ 后取出ꎬ每个浓度做 ３ 次重复ꎮ
采用引物 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４( Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ１９９０) 对 ＩＴＳ 基 采用 ＴＴＣ(２ꎬ３ꎬ５－氯化三苯基四氮唑) 法判定
因序列进行扩增及测序ꎮ 测序成功的 ＩＴＳ 序列通 ＭＩＣ 结果ꎮ 向上述培养 １８ ｈ 后的 ９６ 孔板每孔分
过 ＢｉｏＥｄｉｔ 分析软件校对、拼接、剪切ꎬ将剪切后的 别加入 ２０ μＬ ０.５％的 ＴＴＣꎬ３７ ℃ 避光培养 １ ｈꎬ观
序列逐一通过 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库的 Ｂｌａｓｔ 进行在线 察菌液变化情况ꎮ 试验样本溶液澄清、颜色未发