Page 7 - 广西植物2024年1期

１ 期 高鑫祯等: 珍稀濒危飘带兜兰叶绿体全基因组种内变异研究 ３

仲健等ꎬ ２００９)ꎮ 兜兰的唇瓣因形似拖鞋而被称 (Ｐ. ｐａｒｉｓｈｉｉ ＿ １ 和 Ｐ. ｐａｒｉｓｈｉｉ ＿ ２) 及 澜 沧 县 ( Ｐ.
为“ 拖鞋兰”ꎬ具有极高的观赏价值 ( 杨颖婕等ꎬ ｐａｒｉｓｈｉｉ＿３ 和 Ｐ. ｐａｒｉｓｈｉｉ＿４) 两个野生居群 (图 １)ꎬ取
２０２１)ꎮ 近年来ꎬ兜兰属植物的自然生境局限于生 新鲜叶片放入硅胶中干燥ꎮ 采用植物基因组 ＤＮＡ
态环境脆弱的喀斯特地区ꎬ加上过度采挖等人类 提取试剂盒 ( ＴＩＡＮＧＥＮꎬ 中国北京) 提取叶片总
活动导致的生态退化和生境严重破坏ꎬ使得兜兰 ＤＮＡꎬ使 用 ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑ 文 库 建 立 试 剂 盒 ( Ｓａｎ
属植物野生种群数量急剧减少ꎬ部分兜兰属植物 Ｄｉｅｇｏꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ) 构 建 测 序 文 库ꎬ 利 用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ
面临野外灭绝的风险 ( 罗毅波等ꎬ ２００３ꎻ 杨颖婕 Ｈｉｓｅｑ ２５００ 测序平台 (上海派森诺生物科技有限公
等ꎬ ２０２１)ꎮ 目前ꎬ所有野生兜兰种类均列入« 濒 司) 进行浅层基因组测序ꎮ 同时ꎬ在 ＧｅｎＢａｎｋ 上下

危野生动植物 种 国 际 贸 易 公 约» ( Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｏｎ 载已公开的另外 ２ 个飘带兜兰个体的叶绿体基因组
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｄｅ ｉｎ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｗｉｌｄ 序列 ( Ｐ. ｐａｒｉｓｈｉｉ ＿５ꎬ ＭＷ５２８２１３ 和 Ｐ. ｐａｒｉｓｈｉｉ ＿６ꎬ
Ｆａｕｎａ ａｎｄ Ｆｌｏｒａꎬ ＣＩＴＥＳ)ꎬ同时我国分布的野生兜 ＭＮ５８７８２２)进行比较基因组分析ꎮ
兰属植物也全部列入« 国家重点保护野生植物名 １.２ 叶绿体基因组的组装和注释
录» (２０２１ 年 ９ 月颁布实施)ꎮ 因此ꎬ我国野生兜 采用 Ｆａｓｔｐ 软 件 对 下 机 后 的 原 始 数 据 ( ｒａｗ
兰属物种的濒危机制与保护工作急需开展ꎮ ｄａｔａ) 进 行 过 滤ꎬ 获 得 高 质 量 测 序 数 据 ( ｃｌｅａｎ
飘带兜兰 ( Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ ｐａｒｉｓｈｉｉ ) 为附生兰 ｄａｔａ) 后ꎬ用 ＧｅｔＯｒｇａｎｅｌｌｅ ｖ１.６.３ 程序将测序后得
科植物ꎬ生于海拔 １ ０００ ~ １ １００ ｍ 的树干或石头 到的数据组装成叶绿体基因组 (Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ
上ꎬ为我国一级重点保护植物ꎮ 飘带兜兰被世界 组装完成后的叶绿体基因组数据用 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ
自然保护联盟 ( Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｖ２０２１.２.２ 的 ＭＡＦＦＴ 工具进行比对后ꎬ使用在线工
ｏｆ Ｎａｔｕｒｅꎬ ＩＵＣＮ) 评估为濒危等级 ( Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄꎬ 具 ＣＰＧＡＶＡＳ２ (ｈｔｔｐ:/ / ４７.９０.２４１.８５:１６０１９/ ａｎａｌｙｚｅｒ/
ＥＲ)ꎬ仅在中国云南南部、泰国、缅甸和老挝分布 ａｎｎｏｔａｔｅ２) ( Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９ )ꎬ ＧｅＳｅｑ ( ｈｔｔｐｓ:/ /
有少数的野生种群 (Ｒａｎｋｏｕ ＆ Ａｖｅｒｙａｎｏｖꎬ ２０１５)ꎮ ｃｈｌｏｒｏｂｏｘ.ｍｐｉｍｐ￣ｇｏｌｍ.ｍｐｇ.ｄｅ/ ｇｅｓｅｑ.ｈｔｍｌ) (Ｔｉｌｌｉｃｈ ｅｔ
飘带兜兰具有极高的观赏价值ꎬ在各植物园均有 ａｌ.ꎬ ２０１７) 和 ｔＲＮＡ￣ｓｃａｎ￣ＳＥ ｖ２.０.３ (Ｌｏｗｅ ＆ Ｃｈａｎꎬ
引种ꎬ但野生种群已极为罕见ꎮ Ｃｈｅｎ 等 ( ２０１２) ２０１６) 对叶绿体基因组的蛋白质编码区、核糖体
在云南南部进行了飘带兜兰繁殖生物学的观察ꎬ ＲＮＡ (ｒＲＮＡ) 和转运 ＲＮＡ ( ｔＲＮＡ) 进行注释ꎬ参
发现该种具有独特的自动授粉机制ꎮ 基于叶绿体 考已发表的兜兰属叶绿体基因组对注释结果进行
全基因组发育基因组学的研究ꎬ飘带兜兰属于兜 校正ꎮ 通 过 ＯＧＤＲＡＷ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｃｈｌｏｒｏｂｏｘ. ｍｐｉｍｐ￣
兰 亚 属 ( ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ ) ( Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ｇｏｌｍ.ｍｐｇ.ｄｅ / ＯＧＤｒａｗ. ｈｔｍｌ) 在线网站绘制飘带兜
２０２１)ꎮ 但是ꎬ有关飘带兜兰的遗传信息仍不完 兰叶绿体基因组图谱 ( Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ 使用
善ꎬ缺乏评估遗传多样性及种内多样性的分子标 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ２０２１.２.２ 软件分析 ６ 个飘带兜兰叶
记ꎬ不利于对其开展综合保护ꎮ 绿体基因组的基本结构ꎬ统计 ＬＳＣ、ＳＳＣ、ＩＲ 的长度
本研究选取飘带兜兰的 ４ 个野生个体进行浅层 以及 ＧＣ 含量、蛋白质编码基因、ｔＲＮＡ 基因、ｒＲＮＡ
基因组测序、组装获得叶绿体全基因组ꎬ并与已公 基因的数目ꎮ

开的该种 ２ 个个体叶绿体基因组 (Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ꎻ １.３ 叶绿体基因组重复序列和 ＳＳＲ 分析
Ｋａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１) 进行基因组比较ꎬ分析飘带兜兰叶 通过 ＭＩＳＡ 在 线 网 站 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂｂｌａｓｔ. ｉｐｋ￣
绿体基因组的种内变异ꎬ理解其基因进化水平和遗 ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ.ｄｅ / ｍｉｓａ) ( Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７) 测算叶
传多样性ꎬ以期开发种内多态性的分子标记用于保 绿 体 基 因 组 中 简 单 重 复 序 列 ( ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
护生物学研究ꎬ为开展飘带兜兰的濒危机制及物种 ｒｅｐｅａｔｓꎬ ＳＳＲ) 的分布ꎬ将核苷酸最小重复数分别

保护研究提供遗传信息基础资料ꎮ 设 置 为 １０ ( 单 核 苷 酸 重 复 ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｒｅｐｅａｔｓ)、５ ( 二核苷酸重复 ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ)、４
１ 材料与方法 (三核苷酸重复 ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ)、３ ( 四核苷酸
重复 ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ)、 ３ ( 五 核 苷 酸 重 复
１.１ 研究材料及 ＤＮＡ 提取、测序 ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ )、 ３ ( 六 核 苷 酸 重 复
飘带兜兰 ４ 个 个 体 分 别 采 自 云 南 省 勐 腊 县 ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ)ꎮ