Page 27 - 《广西植物》2024年第10期

１０ 期 霍雯雯等: 红花檵木异常叶色现象与叶片内生细菌的相关性 １ ８ ２ ９

用于植物的生长发育而引起了其表型变化( Ｈｏｕ ｅｔ
ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 因此ꎬ明确红花檵木正常红色叶片和
异常叶色叶片的微生物群落及多样性差异ꎬ有助
于证明叶内细菌群落变化是因为叶色异常的“ 逆
境”引起微生物变化的共同进化的结果ꎬ还是促使
叶片异常叶色形成的诱因ꎬ并且从中还可筛选获

得更多的优良菌种资源ꎮ
因此ꎬ本研究以红花檵木异常叶色和正常红

色叶片为研究对象ꎬ采用平板分离培养法和 １６Ｓ
ｒＤＮＡ 序列分析法分离鉴定内生细菌ꎬ通过多样性
分析、群落结构分析和功能细菌测定筛选结果比

较不同叶色叶片的差异性ꎬ深入探讨以下问题:
(１)红花檵木叶片的内生细菌多样性及群落结构
特征ꎻ(２)红花檵木各叶色类型叶片的内生细菌种
类及结构差异性ꎻ(３)红花檵木异常叶色现象下的
叶片功能菌群转变ꎮ 以期获悉与红花檵木呈现异
常叶色现象密切相关的微生物ꎬ为进一步明确红
Ａ. 红花檵木正常红色(ＺＣ)叶片ꎻ Ｂ. 红黄相间类型(ＨＨ)叶
花檵木异常叶色的形成机制奠定基础ꎻ从叶片富
片ꎻ Ｃ. 黄绿相间类型(ＨＬ)叶片ꎻ Ｄ. 完全黄化类型(ＱＨ)叶
集的内生细菌中发现功能菌ꎬ为后期的促生栽培 片ꎻ Ｅ. 小叶类型(ＸＹ)叶片ꎻ Ｆ. 红斑类型(ＨＢ)叶片ꎮ
提供宝贵菌种资源ꎮ Ａ. Ｎｏｒｍａｌｌｙ ｒｅｄ￣ｃｏｌｏｒｅｄ ｌｅａｆ ｏｆ Ｌ. ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｖａｒ. ｒｕｂｒｕｍ (ＺＣ)ꎻ
Ｂ. Ｒｅｄ ａｎｄ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ (ＨＨ)ꎻ Ｃ. Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ (ＨＬ)ꎻ
Ｄ. Ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｙｅｌｌｏｗｅｄ ｌｅａｆ ( ＱＨ)ꎻ Ｅ. Ｓｍａｌｌｅｒ ｌｅａｆ ( ＸＹ)ꎻ
１ 材料与方法 Ｆ. Ｒｅｄ￣ｓｐｏｔｔｅｄ ｌｅａｆ (ＨＢ).

图 １ 红花檵木异常叶色叶片与正常红色叶片
１.１ 材料 Ｆｉｇ. １ Ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｏｌｏｒｅｄ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｒｅｄ￣ｃｏｌｏｒｅｄ
１.１.１ 植物材料 于湖南农业大学花卉基地发生 ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｌｏｒｏｐｅｔａｌｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｖａｒ. ｒｕｂｒｕｍ
异常叶色现象较多的区域和其他未出现异常叶色
现象的区域进行红花檵木‘大叶红’ 品种 ５ 种异常 细菌长出以确保分离获得的为内生细菌ꎮ 将消毒
叶色叶片和正常红色叶片的采集ꎬ植物材料如图 １ 后的 ６ 种类型叶片充分研磨进行不同浓度梯度
￣１
￣５
所示ꎮ (１０ ~ １０ ) 稀释后分别吸取 １００ μＬ 均匀涂布于
１.１.２ 培养基 内生细菌分离培养基:Ｒ Ａ、ＮＡ 培 Ｒ Ａ 和 ＮＡ 平板培养基上ꎬ每个处理重复 ３ 次ꎬ２８
２
２
养 基 ( Ｒｅａｓｏｎｅｒ ＆ Ｇｅｌｄｒｅｉｃｈꎬ １９８５ꎻ 郝 士 海ꎬ ℃ 恒温培养 ７ ｄ 后ꎬ记录稀释平板上菌落形态特征
１９９２)ꎮ 溶磷功能筛选鉴定培养基:溶磷培养基 (大小、颜色、表面状态等)ꎬ根据菌落形态选取能
(Ｓｏｌａｒｂｉｏ)ꎮ 固氮功能筛选鉴定培养基:Ａｓｈｂｙ 无 形成单菌落且菌落数最多的稀释梯度处理组计算
氮培养基(Ｓｏｌａｒｂｉｏ)ꎮ 产 ＩＡＡ( Ｉｎｄｏｌｅ￣３￣ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ) 生物量ꎬ挑取该稀释梯度培养的菌落纯化 ３ 次获
筛选 鉴 定 培 养 基: Ｋｉｎｇ 氏 培 养 基 ( 林 国 钦 等ꎬ 得单菌落后转接至 Ｒ Ａ、ＮＡ 试管斜面培养基中培
２
￣１ 养并编号ꎬ形成大量菌落后于 ４ ℃ 保存用于后续
２０２２)ꎬ其中 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ 比色液配方为 ０.５ ｍｏｌＬ
ＦｅＣｌ １.５ ｍＬ、Ｈ ＳＯ ３０ ｍＬ、蒸馏水 ５０ ｍＬꎮ 细菌的分子鉴定确定其分类地位ꎮ 编号格式为
３ ２ ４
１.２ 方法 “培养基类型＋叶片类型＋组内菌种序号”ꎮ
１.２.１ 叶片内生菌分离 分别称取 １ ｇ 红花檵木正 １.２.２ 内生细菌总 ＤＮＡ 提取与鉴定 采用煮沸法
常红色和异常叶色叶片ꎬ自来水冲洗干净ꎬ７５％乙 (Ｐｅｒｅｚ￣Ｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４) 提 取 菌 株 的 基 因 组
醇浸泡 ３０ ｓꎬ０.１％ ＨｇＣｌ 消毒处理 ８ ｍｉｎꎬ用无菌水 ＤＮＡꎬ利用 １６Ｓ 通用引物 ２７Ｆ(５′￣ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣ
２
冲洗 ５ 次ꎬ将最后 １ 次冲洗过叶片的无菌水作为空 ＴＧＧＣＴＣＡＧ￣３′)和 １４９２Ｒ (５′￣ＧＧＴ￣ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
白对照涂布于灭菌的培养基上ꎬ后期观察是否有 ＧＡＣＴＴ￣３′)扩增 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基 因 序 列ꎮ ＰＣＲ 反 应