Page 28 - 《广西植物》2024年第10期

１ ８ ３ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
体系:２ × Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｂｕｆｆｅｒ ２５ μＬꎬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ( １０ 围大于 ＮＡ 培养基ꎬ因此以 Ｒ Ａ 分离培养基培养
２
￣１ 获得的菌群生物量为参考依据计算细菌数量ꎻ红
ｍｍｏｌ Ｌ ) １ μＬꎬ ｄｄ Ｈ Ｏ １８ μＬꎬ ｐｒｉｍｅｒ Ｆ ( １０
２
￣１ ￣１ 花檵木内生细菌在 Ｒ Ａ 分离培养基中的生物量范
ｍｍｏｌＬ ) ２ μＬꎬｐｒｉｍｅｒ Ｒ(１０ ｍｍｏｌＬ ) ２ μＬꎬ ２
￣１
２
４
模 板 ＤＮＡ １ μＬꎬ Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ￣Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ 围为 ３.５０ × １０ ~ １.６０ × １０ ＣＦＵｇ ꎮ ＺＣ 叶片内
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ μＬꎮ 反应程序:预变性 ９５ ℃ ３ ｍｉｎꎬ 生细菌生物量均低于其他的异常叶色叶片ꎬ其中
４ ￣１
变性 ９５ ℃ １５ ｓꎬ退火 ５３ ℃ １５ ｓꎬ延伸 ７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ ＨＨ 的菌群生物量最大ꎬ达 １.６０×１０ ＣＦＵｇ ꎮ
彻底延伸 ７２ ℃ ５ ｍｉｎꎬ共计 ３５ 个循环ꎮ 扩增产物
经 １％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ将条带清晰的 ＰＣＲ 表 １ 红花檵木各类叶色叶片内生细菌生物量
扩增产物送至擎科生物科技有限公司测序ꎬ测得 Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ
ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｌｏｒｏｐｅｔａｌｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｖａｒ. ｒｕｂｒｕｍ
的 细 菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序 列 提 交 到 ＥＺＢｉｏＣｌｏｕｄ
(ｈｔｔｐｓ: / / ｅｚｔａｘｏｎ￣ｅ.ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ. ｎｅｔ/ ) 比 对 确 定 其 分 内生细菌生物量
￣１
Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｉｏｍａｓｓ (ＣＦＵｇ )
类地位ꎬ并将测序结果上传至 ＧｅｎＢａｎｋ 核酸序列
叶片类型
数据库得到登录号ꎮ 利用 ＭＥＧＡ ６.０ 软件对其进 Ｌｅａｆ ｔｙｐｅ 以 Ｒ ２ Ａ 培养基计算 以 ＮＡ 培养基计算
Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ
行系统发育分析ꎬ采用邻接法( ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ) 构 Ｒ ２ Ａ ｍｅｄｉｕｍ ＮＡ ｍｅｄｉｕｍ
建系统发育树ꎬ模型为 Ｋ２Ｐ( ｋｉｍｕｒａ ２ ｐａｒａｍｅｔｅｒ)ꎬ
ＺＣ ３５０.００±１４４.９１ｃ ２００.００±１１７.０４ｃ
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 置信值估算重复数设定为１ ０００次ꎮ
ＨＨ １６ ０００.００±１ １５４.７０ａ ３３３.００±４１.８０ｃ
１.２. ３ 多 样 性 分 析 利 用 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ ( Ｈ)、
ＨＬ ５ ０００.００±３７５.２８ｂ ３６７.００±７５.０３ｃ
Ｓｉｍｐｓｏｎ(Ｄ)多样性指数及群落组成结构分析群落
ＸＹ １ ９００.００±４６１.８８ｃ １ １３０.００±３５０.００ａ
结构特征(许晴等ꎬ２０１１)ꎮ
ＱＨ ５００.００±５.７７ｃ ７００.００±１０１.４９ｂ
计算公式如下:
Ｓ Ｓ ＨＢ ３ ７３０.００±７５.０６ｂ ５３３.００±１７１.６２ｂｃ
２
Ｈ ＝ －∑Ｐ ｌｎ Ｐ ꎻ Ｄ ＝ １－∑Ｐ ꎮ
ｉ
ｉ
ｉ
ｉ ＝ １ ｉ ＝ １
注: 表中数据为平均数±标准差(ｎ ＝ ３)ꎮ 不同小写字母表示
式中: Ｓ 为总物种数ꎻＰ 为第 ｉ 个物种的比例ꎻ
ｉ 差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ 表中字母缩写详见图 １ 图注ꎮ 下同ꎮ
ｌｎ 为 Ｐ 的自然对数ꎮ Ｎｏｔｅ: Ｄａｔａ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ａｒｅ ｘ ± ｓ ( ｎ ＝ ３). Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ
ｉ
１.２.４ 内生菌功能研究 (１) 供试菌株:红花檵木 ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ( Ｐ< ０.０５). Ｔｈｅ ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ
ｌｅｔｔｅｒｓ ｓｅｅ Ｆｉｇ. １ ｆｏｒ ｄｅｔａｉｌｓ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
异常叶色和正常红色叶片中分离并挑选出的 ４０
株鉴定结果为不同种的内生细菌ꎮ ２.２ 红花檵木叶片内生细菌的分子生物学鉴定
(２)功能测定:溶磷功能测定方法参照赵龙飞 结合红花檵木异常叶色与正常红色叶片的内
等( ２０１５ )ꎻ 固 氮 功 能 测 定 方 法 参 照 罗 义 等
生细菌菌落形态特征初步归类后ꎬ采用 １６Ｓ ｒＤＮＡ
(２０２３)ꎻ产 ＩＡＡ 功能测定方法参照 Ｐａｔｔｅｎ 和 Ｇｌｉｃｋ
序列分析法进行同源性比对分析ꎬ并构建系统发
(２００２)ꎻ耐盐功能测定是将菌株活化后接种至添 育树(图 ２)ꎮ 由图 ２ 可知ꎬ共从红花檵木各类型叶
加不同质量分数 ＮａＣｌ(０.５％、３.０％、６.０％、９.０％、 片中分离获得 ９０６ 株细菌(表 ２)ꎬ内生细菌数量依
１２.０％、１５.０％)的 ＮＡ 培养基上ꎬ于 ３０ ℃ 培养 ８ ｄꎬ 次为 ＨＨ>ＨＬ>ＨＢ>ＸＹ>ＱＨ>ＺＣꎮ 此外ꎬ经鉴定从
３ 次重复ꎬ记录菌株生长情况ꎮ 正常红色、红黄和黄绿 ３ 种类型叶片中分离到的
１.３ 数据分析 细菌鉴定归类均为 ６ 属 ６ 种ꎻ小叶类型叶片的内生
采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６、ＳＰＳＳ ２１.０ 和 ＧｒａｐｈＰａｄ 细菌鉴定归类为 １３ 属 １５ 种ꎻ完全黄化类型叶片的
Ｐｒｉｓｍ ８ 软件进行数据统计分析和绘图ꎮ 内生细菌鉴定归类为 ４ 属 ５ 种ꎻ红斑类型的叶片内

生细菌鉴定归类为 ７ 属 １２ 种ꎮ
２ 结果与分析 ２.３ 不同叶色类型叶片的内生细菌多样性及群落
组成结构分析
２.１ 红花檵木叶内生细菌的数量及分布特点 内生细菌多样性指数统计结果如表 ３ 所示ꎬ６
内生细菌生物量如表 １ 所示ꎬ６ 类红花檵木叶 类红花檵木叶内生细菌的 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ、Ｓｉｍｐｓｏｎ
内生细菌在 Ｒ Ａ 分离培养基中分离到的生物量范 指数范围分别为 ０.３９~１.７９ 和 ０.０２ ~ ０.８１ꎮ 从代表
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