Page 66 - 《广西植物》2024年第12期
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２ ２ ２ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
验材料ꎬ于 ２５ ℃ 恒温、７０％ 湿度、中日照(１２ ｈ 光 １.５ ＴｒｘＧ 基因家族成员在不同组织、器官中的表
照 / １２ ｈ 黑暗)条件下的植物生长室内生长ꎮ 待大 达模式分析
豆幼苗生长至第 １ 个三出复叶完全展开时ꎬ模拟 从 Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ 数据库中收集大豆 ＧｍＴｒｘＧ 基
高温、低温、盐害、干旱以及激素( ＪＡ、ＳＡ) 处 理ꎮ 因家族成员在不同组织、器官( 包括根、根尖、侧
具体如下:(１)将大豆幼苗分别置于 ４０ ℃ 和 ４ ℃ 根、茎、茎尖、叶、花、种子等) 中的 ＦＰＫＭ 数据ꎬ利
的光照培养箱中以模拟高温和低温胁迫ꎻ(２) 分别 用 ＴＢｔｏｏｌｓ 软 件 进 行 数 据 分 析 并 绘 制 基 因 表 达
使用 １５０ ｍｍｏｌＬ 的 ＮａＣｌ 和 １０％ ＰＥＧ６０００ 溶液 热图ꎮ
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浇灌大豆幼苗以模拟盐害和干旱胁迫ꎻ(３) 对大豆 １.６ 实时荧光定量 ＰＣＲ 检测
幼苗 叶 片 分 别 喷 施 ２００ μｍｏｌ Ｌ 茉 莉 酸 甲 酯 Ｔｒｉｚｏｌ 法提取不同胁迫处理下的大豆幼嫩叶片
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(ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅꎬ ＭｅＪＡ) 和 ２ ｍｍｏｌ Ｌ 水 杨 酸 总 ＲＮＡꎬ利用反转录试剂盒(ＦｅｒｍａｎｔａｓꎬＫ１６２２) 合
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(ＳＡ) 溶液以模拟 ＪＡ 和 ＳＡ 激素处理ꎮ 对于模拟 成 ｃＤＮＡꎮ 以 合 成 的 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 使 用 ＳＹＢＲ
高温、低温、盐害、干旱胁迫的大豆幼苗分别于 ０、 Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ( Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓꎬ Ａ２５７４２) 进
２４、４８ ｈ 取样ꎻ而 ＪＡ 和 ＳＡ 处理的大豆幼苗分别于 行实时荧光定量 ＰＣＲ 检测ꎮ ＰＣＲ 体系如下:２ ×
０、４、８ ｈ 取样ꎮ 以上实验均包含 ３ 次独立的生物 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １０ μＬꎻ正反向引物 Ｆ 和 Ｒ
学重复ꎮ 各 ０.４ μＬꎻｃＤＮＡ 模板 １ μＬꎻｄｄＨ Ｏ ８.２ μＬꎮ 利用
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１.２ ＴｒｘＧ 家族蛋白成员的获得与鉴定 ＣＦＸ９６ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ( 伯乐公司ꎬ美国) 荧 光 定 量
以拟南芥 ＴｒｘＧ 蛋白序列( ＡＴＸ１￣５、ＡＴＸＲ３ 和 ＰＣＲ 仪 进 行 ＰＣＲ 扩 增 反 应ꎬ 反 应 程 序: 预 热 ９５
ＡＴＸＲ７)分别作为参考序列ꎬ在 Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ 数据库 ℃ ꎬ２ ｍｉｎꎻ预变性 ９５ ℃ ꎬ４０ ｓꎻ４０ 个循环:变性 ９５
(ｈｔｔｐｓ: / / ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ￣ｎｅｘｔ.ｊｇｉ. ｄｏｅ. ｇｏｖ / ) 中进行检索 ℃ ꎬ１０ ｓꎻ退火和延伸 ６０ ℃ ꎬ３０ ｓꎮ 使用 ２ －DDＣｔ 法计
和比对 分 析ꎮ 将 获 得 的 可 能 同 源 蛋 白 序 列 于 算 基 因 相 对 表 达 量ꎮ 大 豆 ＧｍＡｃｔｉｎ ( Ｇｌｙｍａ.
ＳＭＡＲＴ 数据库( ｈｔｔｐ: / / ｓｍａｒｔ. ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ. ｄｅ / ) １８Ｇ２９０８００)基因作为内参(Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎬ本
和 ＮＣＢＩ 中 ＣＤＤ 在 线 预 测 网 站 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. 研究中所用到的引物如表 １ 所示ꎮ
ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ. ｃｇｉ?) 进行结
构域组成分析ꎬ确定大豆 ＧｍＴｒｘＧ 蛋白成员ꎬ并依 ２ 结果与分析
据其与相应拟南芥 ＴｒｘＧ 蛋白的亲缘关系远近依次
以 ａ、ｂ、ｃ、ｄ 进行命名ꎮ ２.１ 大豆 ＴｒｘＧ 基因家族成员的鉴定及理化性质
１.３ 染色体位置、基因结构、结构域组成以及蛋白 分析
理化性质分析 在大豆中共鉴定到 １５ 个拟南芥 ＴｒｘＧ 同源蛋
在 Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ 数据库中获取大豆 ＧｍＴｒｘＧ 家族 白 成 员 ( 表 ２ )ꎬ 其 中 拟 南 芥 ＡＴＸＲ３ / ＳＤＧ２ 和
成员基因 ＩＤ、转录本数量、染色体上分布位置、基 ＡＴＸ３ / ＳＤＧ１４ 在大豆中的同源蛋白成员各有 ４ 个ꎬ
因序列、ＣＤＳ 序列、氨基酸序列等ꎮ 利用在线工具 分 别 是 ＧｍＳＤＧ２ａ / ｂ / ｃ / ｄ 和 ＧｍＳＤＧ１４ａ / ｂ / ｃ / ｄꎻ
ＧＳＤＳ(ｈｔｔｐ: / / ｇｓｄｓ.ｇａｏ￣ｌａｂ.ｏｒｇ / ) 绘制基因结构图ꎮ ＡＴＸ２ / ＳＤＧ３０、 ＡＴＸ４ / ＳＤＧ１６ 和 ＡＴＸＲ７ / ＳＤＧ２５ 同
利用 ＳＭＡＲＴ 网站在线分析各蛋白的结构域组成 源 蛋 白 成 员 各 有 ２ 个ꎬ 分 别 是 ＧｍＳＤＧ３０ａ / ｂ、
特征ꎮ 利 用 Ｅｘｐａｓｙ 在 线 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ＧｍＳＤＧ１６ａ / ｂ 和 ＧｍＳＤＧ２５ａ / ｂꎻＡＴＸ５ / ＳＤＧ２９ 同源
ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 分析各成员蛋白的相对分 蛋白成员仅 １ 个ꎬ即 ＧｍＳＤＧ２９ꎮ ＧｍＴｒｘＧ 基因编码
子质量和等电点等理化性质ꎮ 的氨基酸长度为 ９８２ ~ ２ ３９４ ａａꎮ ＧｍＳＤＧ２９ 蛋白的
１.４ 系统进化树的构建 同 分 异 构 体 数 量 最 多ꎬ 共 有 １０ 种ꎮ ５ 个 蛋 白
运用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １.８３ 软件对拟南芥和大豆 ＴｒｘＧ (ＧｍＳＤＧ２ａ / ｂ / ｃ / ｄ 和 ＧｍＳＤＧ３０ａ ) 的 等 电 点 在
家族成员的氨基酸序列进行多重序列比对ꎮ 使用 ６.２２ ~ ６.９５ 之间ꎬ为酸性蛋白ꎻ其余 １０ 个蛋白的等
ＭＥＧＡ ７.０ 软件中的比邻法( ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ) 电点在 ７.７２ ~ ９.０３ 之间ꎬ为碱性蛋白ꎮ 鉴定到的
构建 系 统 进 化 树ꎬ 设 置 参 数 如 下: 校 验 参 数 １５ 个 ＧｍＴｒｘＧ 蛋白不稳定系数介于 ５６.２７ ~ ７６.１０
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｍｅｔｈｏｄ 为 ５００ꎻ 替 换 模 型 为 Ｐｏｉｓｓｏｎ 之间ꎬ为不稳定蛋白ꎮ 亲水性分析结果表明 １５ 个
ｍｏｄｅｌꎻ缺口设置为 Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎꎮ ＧｍＴｒｘＧ 蛋白均为亲水性蛋白ꎮ
