Page 146 - 《广西植物》2024年第2期
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３ ４ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
养法置于含有 ＰＤＡ 培养基的一次性培养皿中ꎬ在 真菌和 １ 株细菌ꎬ从叶鞘中分离得到 ９ 株真菌和 ２
２５ ℃ 恒温条件下培养ꎬ３ ~ ５ ｄ 后观察菌丝体、分 株细菌ꎬ从块茎中分离得到 ３ 株真菌和 １ 株细菌ꎬ
生孢子的形态ꎬ用 ｌｅｉｋａ 正置式显微镜 ＤＭ２５００ 拍 这说明分离的菌种相对较多且较为复杂ꎬ但不同
照ꎬ并测量分生孢子大小(长、宽) 及菌丝直径ꎮ 同 组织部位均没有分离到霉菌ꎮ 真菌编号为 ＧＦ￣１ ~
时ꎬ查阅文献资料进行初步鉴定ꎮ ＧＦ￣１４ꎬ细菌编号为 ＧＢ￣１ ~ ＧＢ￣４ꎬ其中 ＧＦ￣１ 和 ＧＦ￣
１.２.４ 病原菌的分子生物学鉴定 刮取菌丝ꎬ用液 ７ 在叶片、叶鞘以及块茎中均能分离得到ꎮ 图 ２:Ａ
氮研磨法破壁ꎬ采用 ＣＴＡＢ 法提取病原菌菌丝的 示部分分离的菌株ꎮ
ＤＮＡꎮ 采用真菌通用引物对 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 进行 ＰＣＲ ２.２ 病原菌的致病性测定
扩增ꎬ将获得的 ＤＮＡ 片段进行 １％的琼脂糖凝胶 分别对 １８ 株菌株进行室内回接ꎬ接种 ３ ｄ 后
电泳检验ꎮ ＰＣＲ 产物的纯化和测序由武汉擎科创 观察ꎬ发现真菌 ＧＦ￣１、ＧＦ￣４、ＧＦ￣５ 和 ＧＦ￣７ 出现较
新生物有限科技公司完成ꎬ将所得序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 明显的致病症状( 图 ２:Ｂ)ꎬ６ ｄ 后统计发病率( 表
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ) 中核酸数据进行 １)ꎮ 对室内接种发病率较高的 ＧＦ￣１、ＧＦ￣４、ＧＦ￣５
ＢＬＡＳＴ 分 析ꎬ 利 用 Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＡｄｖａｎｃｅ １１ 进 行 比 和 ＧＦ￣７ 等进行田间回接ꎬ发现仅 ＧＦ￣１ 接种部位
对ꎬ通过 ＭＥＧＡ ５.０ 进行 ＵＰＧＭＡ 分析生成系统发 呈现黑斑、有烧焦状、中间部位干枯( 图 ３:Ａ)ꎬ室
育树ꎮ 通过同源性分析ꎬ对病原菌菌种进行分子 内回接有明显的黄色晕斑( 图 ２:Ｂ 中的 ＧＦ￣１)ꎬ切
水平鉴定(李若瑜等ꎬ２００２)ꎮ 开根茎后有腐烂( 图 ２:Ｃ)ꎬ与田间采取病株时的
１.２.５ 中 药 材 提 取 物 对 根 腐 病 病 原 菌 的 抑 制 效 病害症状基本一致ꎻ其他菌株因致病病斑和对照
应 把 ７ 种备试中药材于烘箱中 ６０ ℃ 烘干ꎬ粉 组没有继续扩大或者无感病症状而接种部位干枯
碎ꎬ过 ４０ 目筛(孔径 ０.４２５ ｍｍ)ꎬ密封后于－２０ ℃ (图 ３:Ｂ－Ｅ)ꎮ 从接种 ＧＦ￣１ 的发病组织中重新分
下保存待用ꎮ 将乙醇作为溶剂ꎬ采用 ３ 次振荡浸 离获得的病原菌ꎬ经纯化培养后与接种的病原菌
提法提取(韩建华等ꎬ２００２)ꎬ合并 ３ 次滤液进行减 完全一致ꎬ符合柯赫式法则ꎬ这充分表明分离获得
压浓缩至质量浓度为 １ ｇｍＬ ꎬ密封后于 ４ ℃ 冰 的病原菌为该病的致病菌ꎮ
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箱中保存ꎮ 采用菌丝生长速率法( 吴文君ꎬ１９８８) ２.３ 病原菌形态学鉴定
测定中药材提取液对白及根腐病致病菌的抑制效 病原菌 ＧＦ￣１ 在 ＰＤＡ 培养基上ꎬ于 ２５ ℃ 恒温
￣１ 条件下培养 ５ ｄ ꎬ长出白色绒絮状菌落ꎬ菌丝匍匐
果ꎮ 取质量浓度 １ ｇｍＬ 的中药提取液加入 ＰＤＡ
培养基中ꎬ摇匀ꎬ参照前人的浓度设计梯度制成浓 向外、向上生长ꎬ气生ꎬ菌落絮状ꎬ白色ꎬ圆形ꎬ菌落
度分别为 ０.０５、０.１、０.２ ｇｍＬ 的带药平板( 马伟 背部中心褐色或黑褐色ꎬ周围绿褐色至黄褐色( 图
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等ꎬ２０１０ꎻ刘莹等ꎬ２０１９)ꎬ以加入无菌水的 ＰＤＡ 培 ４:ＡꎬＢ)ꎮ 菌丝无色ꎬ生长较快ꎬ有隔 膜ꎬ直 径 为
养基为空白对照ꎮ 选用直径为 ５ ｍｍ 的打孔器ꎬ打 ３.２ ~ ６.９ μｍꎬ其分生孢子梗多分枝ꎻ厚垣孢子为长
取菌落边缘的菌饼ꎬ接种于带药平板上ꎬ每组处理 方形或椭圆形ꎬ大小为 (６.５ ~ ９.６) μｍ×(６.５ ~ ７.１)
重复 ３ 次ꎬ于 ２５ ℃ 恒温下培养ꎮ 培养 ４８ ｈꎬ每隔 μｍꎬ分生孢子散生ꎬ呈卵形ꎬ大小为(５.３ ~ ８.９) μｍ×
２４ ｈ 用十字交叉法测量菌落直径ꎬ连续记录 ７ 次 (１.４ ~ ３.６)μｍ(图 ４:ＣꎬＤ)ꎮ 菌落培养 ５ ｄ 后直径
结果ꎬ计算抑制生长率ꎮ 计算公式:抑制生长率 ＝ 为 ５.２ ~ ７.０ ｃｍ(培养皿 Φ ＝ ９０ ｍｍ)ꎮ 对照中国真
[(对照菌落直径－处理菌落直径) / ( 对照菌落直 菌志没有发现类似的真菌种类ꎬ经查阅相关文献
径－菌饼直径 ５.０ ｍｍ)] ×１００％ꎮ 资料(Ａｖｅｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１０)ꎬ初步判断 ＧＦ￣１ 病原
菌为附球菌属病原菌ꎮ
２ 结果与分析 ２.４ 病原菌 ＩＴＳ 区的序列系统发育分析
对菌株 ＧＦ￣１ 的 ＩＴＳ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增产物进
２.１ 病原菌的分离 行测序、校对、剪切和拼接ꎬ获得全长为 ５５２ ｂｐ 的序
根据田间症状ꎬ初步判断为根腐病或叶斑病ꎮ 列ꎮ 将序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中的相关数据进行一致性分
从感病植株的叶片、叶鞘和块茎的病健交界处分 析ꎬ结果表明菌株 ＧＦ￣１ 的 ＩＴＳ 序列(ＴＳＢ１Ｇ６４３０１３)
别取样ꎬ分离病原菌ꎬ共分离出病原菌 １８ 株( 真菌 与甘蔗的高粱附球菌( Ｅ. ｓｏｒｇｈｉｎｕｍꎬＭＮ４９３１１９.１)
１４ 株、细菌 ４ 株)ꎮ 其中ꎬ从叶片中分离得到 ２ 株 序列一致性最高ꎬ为 ９９.６２％ꎬ 而与白及中分离的
