Page 35 - 《广西植物》2024年第2期
P. 35
２ 期 刘瑞等: 中国沙棘 ＨｒＡＮＲ 基因及黄酮类累积与抗旱的关系 ２ ３ ７
因序列信息及其同源性ꎻ(２) 干旱胁迫下 ＨｒＡＮＲ 行 ＰＣＲ 扩增ꎬ产物进行凝胶电泳检测ꎬ对获得的条
基因的时间表达特性ꎻ(３) ＨｒＡＮＲ 基因的时空表达 带单一大小符合预期的扩增产物送往生工生物工
与总黄酮含量是否存在直接关系ꎮ 旨在为黄酮类 程(上海)有限公司进行双向测序ꎮ
与中国沙棘抗旱性之间的关系阐明提供依据ꎮ １.５ 生物信息学分析
核苷 酸 和 氨 基 酸 序 列 特 征 用 Ｅｄｉｔｓｅｑ 分 析ꎮ
１ 材料与方法 ＨｒＡＮＲ 基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、稳
定性 等 采 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
１.１ 试验材料 ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 进 行 分 析ꎻ 利 用 Ｋｙｔｅ￣Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 分 析
采集 青 海 省 西 宁 市 湟 源 县 ( １０１° １４′ １１″ Ｅ、 ＨｒＡＮＲ 蛋白的疏水性ꎬ利用 Ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ(ｈｔｔｐ: / /
３６°４６′２４″ Ｎꎬ海拔 ３ ０１０ ｍ)的中国沙棘种子在青海 ｗｗｗ. ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ. ｏｒｇ / ) 和 Ｓｗｉｓｓ ｍｏｄｅｌ ( ｈｔｔｐｓ: / /
省玛可河育苗基地播种育苗ꎬ苗木培养采用张丹等 ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ) 进行 ＨｒＡＮＲ 蛋白二级、三
(２０２１)的方法 ꎬ待幼苗生长至 ２０ ｃｍ 左右时ꎬ选择 级结 构 的 分 析ꎻ 利 用 ＳｉｇｎａｌＰ ５. ０ ( ＳｉｇｎａｌＰ￣５. ０￣
健康且无病虫害的一部分幼苗采集叶片进行 ＨｒＡＮＲ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ￣ＤＴＵ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈ) 进行 ＨｒＡＮＲ 蛋白信号
基因的扩增ꎬ另外一部分进行干旱胁迫处理ꎮ 肽 预 测ꎻ 采 用 ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ.
１.２ 干旱胁迫处理 ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅ. ｐｈｐ? ＴＭＨＭＭ￣２. ０) 进 行
选择长势一致且无病虫害的幼苗ꎬ分为对照 跨膜 区 预 测ꎻ 采 用 在 线 分 析 网 站 Ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
(ＣＫ)组和干旱胁迫( ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓꎬ ＤＳ) 处理组ꎬ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ. ｏｒｇ / ) 进 行 蛋 白 质 亚
ＣＫ 组照常浇灌ꎬＤＳ 组停止浇水直至苗木缺水萎 细胞定位预测ꎻ利用 ＤＮＡＭＡＮ 进行同源蛋白序列
蔫ꎮ 在干旱胁迫处理前将苗木灌水浇透ꎬ２４ ｈ 后 分析ꎻ利用 ＮＣＢＩ 中的 Ｂｌａｓｔｐ 进行同 源 序 列 的 搜
开始试验ꎬ在胁迫第 ９ 天复水( 预试验中ꎬＤＳ 组在 索ꎬ使用 ＭＥＧＡ ６.０ 构建 ＮＪ 进化树ꎻ利用 Ｍｅｇａｌｉｎ
第 １０ 天 进 行 复 水 处 理 的 幼 苗 不 能 恢 复 直 至 枯 计算同源性ꎮ
死)ꎬ于每日 ９ 点采样ꎬ每个处理组设 ３ 个平行对 １.６ 实时荧光定量 ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)分析
照ꎮ 分别在胁迫处理的 ０ ｄ( ＣＫ)、３ ｄ( ＤＳ１)、６ ｄ 通过在线软件设计荧光定量引物 ＨｒＡＮＲ￣ＤＬ￣Ｆ:
(ＤＳ２)、９ ｄ(ＤＳ３)、复水 ４８ ｈ( ＲＷ) 采集样本用于 ５′￣ＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＧ 和 ＨｒＡＮＲ￣ＤＬ￣
后续试验ꎬ其中一部分中国沙棘的根茎叶组织分 Ｒ:５′￣ＡＧＣＴＡＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＴＡＧ￣３′ꎮ 选择在
别液氮速冻后存于－ ８０ ℃ ꎬ用于基因表达模式研 不同胁迫下能稳定表达的基因作为内参基因ꎬ根内
究ꎬ另外一部分采集叶片干燥后用于黄酮类含量 参基因选择 ＴＡＴＡ (Ｆ: ５′￣ＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＡＡＡＧＴ
分析ꎬ每个组织每个处理各 ３ 次生物学重复ꎮ ＡＴＧ￣３′ꎬＲ: ５′￣ＧＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＡＡＧＡＡＣＣ￣３′)ꎬ
１.３ 总 ＲＮＡ 的提取及 ｃＤＮＡ 的合成 叶内参基因选择 ＨＩＳ３(Ｆ: ５′￣ＣＣＧＴＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＣ
ＲＮ３８ 植物 ＲＮＡ 试剂盒( 大连艾德莱生物科 ＡＡＣＣ￣３′ꎬＲ: ５′￣ＧＡＡＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡ￣３′)ꎬ
技有限公司ꎬ５０ 次) 提取中国沙棘各组织总 ＲＮＡꎮ 茎内参基因选择 ＰＥＰＣ(Ｆ: ５′￣ＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣ
对微量核酸蛋白测定仪( 美国ꎬ赛默飞世尔科技ꎬ ＧＣＡＡＧ￣３′ꎬ Ｒ: ５′￣ＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＡ￣３′)ꎮ
ＮａｎｏＤｒｏｐ)和 ２％琼脂糖凝胶电泳检测合格的 ＲＮＡ 在 Ｑ２０００ Ｂ 荧光定量 ＰＣＲ 仪( 杭州朗基) 上进行
®
用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ⅱ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｑＲＴ￣ＰＣＲꎬ３ 次生物学重复ꎮ
(ＴａＫａＲａꎬ６２１０Ａꎬ５０ 次)反转录获得 ｃＤＮＡꎮ １.７ 中国沙棘叶片黄酮类提取及含量测定
１.４ ＨｒＡＮＲ 基因的扩增 将干旱胁迫处理的中国沙棘叶片使用冷冻干
根据 前 期 中 国 沙 棘 全 长 转 录 组 测 序 ( ＰＬｏＳ 燥机(上海 ＢＩＬＯＮ￣ＦＤ８０Ａ)干燥后ꎬ使用组织捣碎机
ＯＮＥꎬ ｈｔｔｐｓ: / / ｄｏｉ. ｏｒｇ / １０. １３７１ / ｊｏｕｒｎａｌ. ｐｏｎｅ. (常州ꎬＪＴＬＩＡＮＧＹＨＯＵ￣ＪＪ￣２) 粉碎ꎬ过 ８０ 目筛ꎬ石油
０２０２２１３) 获 得 的 ＨｒＡＮＲ 基 因 序 列 设 计 引 物 醚脱脂后使用王树林(２００８) 的方法提取黄酮类两
ＨｒＡＮＲ￣Ｆ: ５′￣ＡＴＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＡＣＣ￣３′ 和 次ꎬ合 并 提 取 液ꎬ 第 一 次 使 用 ５０％ 乙 醇 ( 物 料 比
ＨｒＡＮＲ￣Ｒ: ５′￣ＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＡＡＣＴＴＣＴＡ￣３′ꎬ 扩 增 产 １ ∶ １０)在 ７０ ℃ 下回流 ２.０ ｈꎬ第二次使用 ５０％乙醇
物 长 度 为 １ ０１７ ｂｐꎬ 使 用 ｒＴａｑ 酶 ( ＴａＫａＲａꎬ (物料比 １ ∶ ８)在 ７０ ℃ 下回流 １.５ ｈꎮ 黄酮类化合
ＤＲ１００Ａꎬ２５０Ｕ) 以中国沙棘叶的 ｃＤＮＡ 为模板进 物的含量用紫外分光光度计[型号 ＤＲ６０００ꎬ美国哈
