Page 36 - 《广西植物》2024年第2期
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２ ３ ８                                  广  西  植  物                                         ４４ 卷
            希公司(ＨＡＣＨ)]进行测定ꎬ本应测量 ２８０ ｎｍ 处原
            花色素含量ꎬ而该方法只适应纯度较高的原花色素
            溶液ꎬ因为儿茶素在此波长有最大吸收ꎬ所以测量
            ５１０ ｎｍ 处总黄酮含量ꎬ使用冯智鹏等(２０１７)的方法
            通过芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所) 制作

            标准曲线ꎮ
            １.８ 数据统计分析

                                －ΔΔＣｔ
                 荧光定量使用 ２           法计算各个样本 ＨｒＡＮＲ
            基因的相对表达量ꎬ黄酮类提取使用 Ｅｘｃｅｌ 建立标
            准曲线ꎬ并使用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０ 和 ＳＰＳＳ ２２ 进

            行数据的统计分析ꎬ图表利用 Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ １４.０ 制作ꎮ

            ２  结果与分析


                                                                      图 １  ＨｒＡＮＲ 基因 ＰＣＲ 扩增电泳图
            ２.１ ＨｒＡＮＲ 基因的克隆及序列分析
                                                              Ｆｉｇ. １  ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＨｒＡＮＲ ｇｅｎｅ
                 以中 国 沙 棘 叶 的 总 ＲＮＡ 经 反 转 录 合 成 的
            ｃＤＮＡ 为模板ꎬ 以 ＨｒＡＮＲ￣Ｆ、 ＨｒＡＮＲ￣Ｒ 为引物进行
            ＰＣＲ 扩增ꎬ得到了单一条带的扩增结果(图 １)ꎮ 对                        ２.３ ＨＲＡＮＲ 同源蛋白的同源性及系统进化树
            扩增得到的基因测序后得到 ＨｒＡＮＲ 基因的序列ꎬ采                             通过 ＮＣＢＩ 查找到 １１ 个与 ＨｒＡＮＲ 蛋白同 源
            用 ＤＮＡＭＡＮ 分析表明其 ＯＲＦ 长度为 １ ０１７ ｂｐꎮ                   [１２ꎬ中国沙棘(Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ. ｓｉｎｅｎｓｉｓ)]
            ２.２ 编码氨基酸序列分析及编码蛋白生物信息学分析                          的序列ꎬ即香椿(Ｔｏｏｎａ ｓｉｎｅｎｓｉｓꎬ１ꎬＱＷＢ４９５０２.１)、荔枝
                 ＨｒＡＮＲ 基因编码 ３３８ 个氨基酸ꎬ 其中 Ｌｅｕ 数                 ( Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬ ２ꎬ ＱＲＶ６１３８０. １ )、 巴 西 海 岛 棉
            量最多(１０.１％)ꎬＴｒｐ 数量最少(０.９％)ꎻ其中带负                     (Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅꎬ ３ꎬ ＡＬＦ３８０９１. １)、 乌 苏 里 杨
            电荷氨基酸残基(Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ)共 ３８ 个ꎬ带正电荷氨                     (Ｐｏｐｕｌｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓꎬ４ꎬＵＮＮ４６８１０.１)、药蜀葵(Ａｌｔｈａｅａ
            基酸残基(Ａｒｇ ＋ Ｌｙｓ)有 ３５ 个ꎻ编码蛋白分子量为                     ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓꎬ５ꎬＵＯＩ８７８３４.１)、龙眼(Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ ｌｏｎｇａｎꎬ
            ３６ ６６０.１９ Ｄａꎬ理论等电点( ｐＩ) 为 ６.０３ꎬ为亲水性                ６ꎬ ＱＲＶ６１３７３. １ )、 可 可 ( Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏꎬ ７ꎬ
            蛋白( 图 ２)ꎬ其中 １９４ 位的异亮氨酸疏水性最强                        ＡＤＤ５１３５４. １ )、 杧 果 ( Ｍａｎｇｉｆｅｒａ      ｉｎｄｉｃａꎬ ８ꎬ
            (２.１７８)ꎬ而 ４３ 位的谷氨酸亲水性最强( －２.６３３)ꎮ                  ＡＸＮ９４０９２. １ )、 越 橘 ( Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍꎬ ９ꎬ
            使用 Ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 预测中国沙棘 ＨｒＡＮＲ 蛋白ꎬ结               ＡＹＣ３５３９８.１)、葡萄(Ｖｉｔｉｓ ｂｅｌｌｕｌａꎬ１０ꎬＡＦＧ２８１７５.１)、银
            果表明该蛋白亚细胞定位在细胞质中ꎬ二级结构                              杏(Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａꎬ１１ꎬＡＡＵ９５０８２.１)ꎮ 对上述植物的
            预测发现ꎬ该基因编码蛋白中 α￣螺旋占 ４０.８３％ꎬ                        ＡＮＲ 氨基酸序列进行多重比对( 图 ５)、分析序列
            无规则卷曲占 ３７.５７％ꎬ延伸链占 １４.２０％ꎬβ￣折叠                     同源性(图 ６)ꎬ并绘制 ＮＪ 系统进化树( 图 ７)ꎮ 使
            为 ７.４０％(图 ３)ꎬ因此说明 α￣螺旋和无规则卷曲                       用 ＤＮＡＭＡＮ 软件对多重序列快速比对ꎬ结果表明

            是 ＨｒＡＮＲ 蛋白二级结构的主要构象单元ꎮ 由图 ４                        其序列一致性达 ８３.３６％ꎬＭｅｇａｌｉｎ 多重序列间单链
            Ｓｗｉｓｓ ｍｏｄｅｌ 预测的中国沙棘 ＨｒＡＮＲ 蛋白的三维                    一致性在 ５７.７％ ~ ９７.０％之间ꎬ其中香椿与中国沙

            结构模型可知ꎬ预测结果与二级结构预测一致ꎮ                              棘 ＨｒＡＮＲ 编码蛋白一致性最高ꎬ达 ８４.２％ꎬ与银杏
            根据 ＳｉｇｎａｌＰ ５.０ 对 ＨｒＡＮＲ 蛋白信号肽的预测结                   差异性最大ꎬ达 ５４.１％ꎮ 从系统进化树关系上看ꎬ

            果可知ꎬ该蛋白信号肽存在的可能性为 ０. １５％ꎬ                          １２ 个物种聚为两大类 ４ 个分支ꎬ其中中国沙棘与
            说明中国沙棘 ＨｒＡＮＲ 蛋白不存在信号肽ꎬ属于                           被子植物聚为一类ꎬ裸子植物银杏单独一簇ꎬ与图
            非 分 泌 蛋 白ꎮ 利 用 ＴＭＨＭＭ 进 行 中 国 沙 棘                   ６ 差异性关系相符且符合进化规律ꎻ另外ꎬ无患子
            ＨｒＡＮＲ 蛋白跨膜区的预测ꎬ结果表明其无跨膜结                           科荔枝与龙眼聚为一组ꎬ锦葵科药蜀葵和巴西海
            构ꎬ这与亚细胞定位结果中该蛋白定位于细胞质                              岛棉聚为一组ꎮ 以上表明 ＡＮＲ 蛋白具有明显的
            的结果一致ꎮ                                             科属特性ꎮ
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