Page 37 - 《广西植物》2025年第1期
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１ 期              项小燕等: 大别山五针松根际微生物和内生菌群落特征及功能多样性                                             ３ ３

            谢产物如生长素、细胞分裂素等ꎬ促进植物细胞分                             １.３ ＰＣＲ 扩增
            裂、根系发育、幼苗生长ꎬ而且还通过促进植物对                                 以稀释后的基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ根据测序区
            土壤中的营养物质吸收而对宿主的生长发育产生                              域 的 选 择ꎬ 使 用 带 Ｂａｒｃｏｄｅ 的 特 异 引 物 和 Ｎｅｗ
            积极影响(刘丽辉等ꎬ ２０２０)ꎮ 尽管越来越多的研                         Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ 公司的 Ｐｈｕｓｉｏｎ ®  Ｈｉｇｈ￣Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ
            究表明根系相关微生物为其宿主植物提供了许多                              Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＧＣＢｕｆｆｅｒ 以及高效高保真酶进行
            有益的功能ꎬ但是大别山五针松根际土壤菌群结                              ＰＣＲ 扩增ꎮ 其中ꎬ细菌采用 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ４ 区基因
            构和根部内生菌群落分布特征如何? 有哪些微生                             ( ５１５Ｆ: ５′￣ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ￣３′ 和 ８０６Ｒ:
            物类群可能成为促进大别山五针松生长发育的重                              ５′￣ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ￣３′)ꎬ 真 菌 采 用
            要资源? 这是本研究旨在解决的两大科学问题ꎮ                             ＩＴＳ１ 区基因(ＩＴＳ５￣１７３７Ｆ: ５′￣ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴ
                 因此ꎬ本研究采集大别山五针松的根际土壤                           ＡＡＣＡＡＧＧ￣３′和 ＩＴＳ２￣２０４３Ｒ: ５′￣ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴ
            和根部组织样品ꎬ利用高通量测序技术ꎬ对根际土                             ＣＧＡＴＧＣ￣３′) 进 行 扩 增ꎮ ＰＣＲ 反 应 体 系: Ｐｈｕｓｉｏｎ
                                                                                                    ￣１
            壤和根内部中的细菌和真菌群落组成进行系统鉴                              Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(２ ×) １５ μＬꎬＰｒｉｍｅｒ(２ μｍｏｌ ) ３ μＬꎬ
                                                                             ￣１
            定ꎬ分析定殖在大别山五针松根系中的优势微生                              ｇＤＮＡ(１ ｎｇμＬ )１ μＬꎬＨ Ｏ １１ μＬꎮ 反应程序:９８
                                                                                       ２
            物类群ꎬ并对其生物功能进行探讨ꎬ以期揭示大别                             ℃预变性 １ ｍｉｎꎬ３０ 个循环(９８ ℃ꎬ １０ ｓꎻ５０ ℃ꎬ ３０
                                                               ｓꎻ７２ ℃ꎬ３０ ｓ)ꎻ７２ ℃ꎬ５ ｍｉｎꎮ 采用 Ｂｉｏ￣ｒａｄ Ｔ１００ 梯
            山五针松根部相关微生物的群落分布特征ꎬ为解
                                                               度 ＰＣＲ 仪ꎬＰＣＲ 产物使用 ２％浓度的琼脂糖凝胶电
            析大别山五针松的环境适应性以及人工复壮大别
                                                               泳检测ꎬ根据 ＰＣＲ 产物浓度进行等浓度混样ꎬ充分
            山五针松种群提供重要理论支撑ꎮ
                                                               混匀后使用１×ＴＡＥ浓度 ２％ 的琼脂糖胶电泳纯化
            １  材料与方法                                           ＰＣＲ 产 物ꎮ 其 中ꎬ 产 物 纯 化 试 剂 盒 使 用 Ｔｈｅｒｍｏ
                                                               Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司 ＧｅｎｅＪＥＴ 胶回收试剂盒ꎮ 选择主带大
                                                               小在 ４００~４５０ ｂｐ 之间的序列ꎬ割胶回收目标条带ꎮ
            １.１ 样品采集
                                                               １.４ 文库构建和上机测序
                 ２０２０ 年 １１ 月上旬ꎬ于大别山五针松自然种群
                                                                             ®
                                                                   使用 ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡＰＣＲ￣Ｆｒｅｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
            (１１５°２４′ Ｅ、３０°４４′ Ｎ) 分布地安徽省岳西县大王
                                                               Ｋｉｔ 建库试剂盒进行文库构建ꎬ构建好的文库经过
            沟海拔 １ ０５０ ~ １ １００ ｍ 范围内ꎬ采集阴坡健康植株
                                                               Ｑｕｂｉｔ 和 Ｑ￣ＰＣＲ 定 量ꎬ 文 库 合 格 后ꎬ 使 用 Ｎｏｖａ
            样品ꎮ 采集样品时ꎬ随机选取 ３ 个 ３ ｍ × ３ ｍ 的样
                                                               Ｓｅｑ６０００ 进行上机测序ꎮ 所得样品 ＤＮＡ 委托北京
            方ꎬ在每个样方中选取 １ 株健康植株ꎮ 去除土壤
                                                               诺禾致源生物信息科技有限公司完成测序ꎮ
            表面落叶和杂草后ꎬ在植株根部一侧小心挖掘ꎬ待
                                                               １.５ 测序数据处理分析
            根系 露 出 后ꎬ 挖 掘 部 分 健 康 根 系 ( 长 度 约 为 １０
                                                                   根据 Ｂａｒｃｏｄｅ 序列和 ＰＣＲ 扩增引物序列ꎬ从下
            ｃｍ)ꎬ采用“抖根法” ( 王香生等ꎬ２０２２)ꎬ收集大别
                                                               机数据中拆分出各样本数据ꎬ截去 Ｂａｒｃｏｄｅ 和引物
            山五针松根际东南西北 ４ 个不同方向土壤混合样
                                                               序列后ꎬ使用 ＦＬＡＳ 软件进行拼接ꎬ得到原始序列
            本ꎬ编号为 ＣＴꎬ作为根际土壤 ＤＮＡ 样本ꎻ取同一植
                                                               数据ꎮ 经 过 严 格 的 过 滤 处 理 ( Ｂｏｋｕｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ
            株东南西北 ４ 个不同方向的混合根样为根部 ＤＮＡ
                                                               ２０１３)后ꎬ参照 Ｑｉｉｍｅ( Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０) 的序
            样本ꎬ编号为 ＣＲꎮ 待所有样本收集完毕ꎬ立即放
                                                               列质量控制流程ꎬ通过与物种注释数据库进行比
            入冰盒带回实验室ꎮ
                                                               对(Ｒｏｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎬ检测且去除嵌合体序列ꎬ
            １.２ 基因组 ＤＮＡ 的提取                                    得到最终的有效数据ꎮ 利用 Ｕｐａｒｓｅ 软件对所有样
                                                    ®
                 对 根 际 土 壤 样 品ꎬ 依 据 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ         ＤＮＡ      本的全部有效数据进行聚类ꎬ以 ９７％的一致性将
            Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ(ＭｏＢｉｏꎬ Ｕ.Ｓ.) 试剂盒说明书中的方法              序列聚类成为操作分类单元( ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
            提取总 ＤＮＡꎮ 根部样品经 ７５％酒精表面消毒后ꎬ                         ｕｎｉｔꎬ ＯＴＵ)ꎬ同时选取出现频数最高的序列作为
            利用改良的十六烷基三甲基溴化铵( ＣＴＡＢ) 方法                          ＯＴＵｓ 的代表序列ꎮ 通过对 ＯＴＵｓ 进行 Ｖｅｎｎ 图分
            (宫强等ꎬ２００５)提取总 ＤＮＡꎮ 利用琼脂糖凝胶电                        析 和 α￣多 样 性 计 算ꎬ得 到 不 同 样 本 共 有 和 特 有
            泳检测 ＤＮＡ 的纯度ꎬ取适量的样本 ＤＮＡ 于离心管                        ＯＴＵｓ 信息以及物种丰富度和均匀度信息ꎮ 利用
                                              ￣１
            中ꎬ使用无菌水稀释样本至 １ ｎｇμＬ ꎮ                            独立样本 ｔ 检验分析不同样本的差异显著性ꎮ 此
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